楊 銘，蘇 博，臺錦閣，汪定成，邵海連，張霄霄，張 倩，董 軻

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710038

肺炎克雷伯菌是臨床常見的引起嚴(yán)重感染的重要病原菌，近年來，其檢出率和耐藥率逐年增高，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐藥率由2013年的4.9%上升至2019年的10.9%，使臨床抗感染治療愈加困難[1-2]。新型抗菌藥物頭孢他啶/阿維巴坦可有效抑制β-內(nèi)酰胺酶，能用于嚴(yán)重革蘭陰性菌感染的治療[3]，這為臨床治療和控制肺炎克雷伯菌，特別是CRKP引起的嚴(yán)重感染提供了新的途徑。本研究通過分析肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥性，以期為臨床抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取2018年1月至2020年6月本院檢出的肺炎克雷伯菌1 785株為研究對象。

1.2儀器與試劑 頭孢他啶(30 μg)/阿維巴坦(20 μg)藥敏紙片(英國Oxoid公司)，VITEK MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)，WalkAway 96 Plus全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，Thermal cycler型PCR儀(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Mini BIS PRO凝膠成像系統(tǒng)分析儀(以色列DNR公司)。TapDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，瓊脂糖(美國Invitrogen公司)，胰蛋白胨、酵母浸出物(英國Oxoid公司)，DL2000 DNA Marker、溴化乙錠(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。PCR擴(kuò)增引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其余試劑為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗(yàn) 采用WalkAway 96 Plus全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀檢測1 785株肺炎克雷伯菌對21種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC) 。對CRKP補(bǔ)充頭孢他啶/阿維巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素及多黏菌素B的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI) 2020版相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.3.2改良碳青霉烯類滅活法(mCIM)和乙二胺四乙酸碳青霉烯類滅活法(eCIM) 對CRKP進(jìn)行檢測，取A、B兩支含2 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)的試管，B管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液混勻，再向A、B管中分別加入1 μL已在血平板上孵育18～24 h的待檢細(xì)菌，震蕩混勻10～15 s。A、B管中分別放入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認(rèn)紙片浸沒于菌懸液中，35 ℃ 4 h孵育；孵育結(jié)束后，用接種環(huán)分別將A、B管中的美羅培南紙片取出，貼于同一塊已涂布有0.5麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌ATCC 25922的MH瓊脂平板上。根據(jù)CLSI 2020相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

1.3.3碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn) 將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腃RKP菌懸液均勻涂布于MH瓊脂平板上，貼4張亞胺培南紙片，1張紙片不滴加任何液體，1張紙片滴加10 μL氨基乙基二苯硼酸酯(APB)溶液，1張紙片滴加10 μL EDTA溶液(初始濃度0.1 mol/L)，1張紙片同時滴加APB溶液和EDTA溶液各10 μL。過夜孵育，量取抑菌圈直徑。結(jié)果判讀如下：如滴加APB溶液使抑菌圈直徑擴(kuò)大5 mm以上，判斷為產(chǎn)A類碳青霉烯酶；如滴加EDTA溶液使抑菌圈直徑擴(kuò)大5 mm以上，判斷為產(chǎn)B類碳青霉烯酶；如同時滴加APB和EDTA溶液使抑菌圈直徑擴(kuò)大5 mm以上，則判斷為同時產(chǎn)A類和B類碳青霉烯酶。

1.3.4碳青霉烯酶耐藥基因檢測 對2020年1-6月收集的19株CRKP進(jìn)行碳青霉烯酶耐藥基因檢測，參考文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水8 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán); 最后再72 ℃延伸4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，序列經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布 1 785株肺炎克雷伯菌分離自痰液的占63.47%，分離自血液的占10.25%，分離自尿液的占9.36%，其他來源占16.92%；檢出率位于前9位的科室依次為腦外科(25.77%)、神經(jīng)內(nèi)科(12.83%)、呼吸科(10.14%)、胸外科(6.61%)、重癥監(jiān)護(hù)室(6.55%)、血液科(4.87%)、骨科(4.08%)、普外科(2.91%)、中醫(yī)科(2.24%)。121株CRKP主要分離自重癥監(jiān)護(hù)室。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 1 785株肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感率為95.49%，藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。121株CRKP對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感率為80.17%，藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 1 785株肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

表2 121株CRKP對補(bǔ)充抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.3mCIM及eCIM檢測結(jié)果 對121株CRKP進(jìn)行mCIM及eCIM檢測，其中101株mCIM陽性，占83.5%(101/121)，產(chǎn)碳青霉烯酶；101株mCIM陽性菌株中，22株eCIM陽性，占21.8%(22/101)，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶。

2.4碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果 對121株CRKP進(jìn)行碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)，78株產(chǎn)絲氨酸酶，占64.5%；22株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，占18.2%；1株同時產(chǎn)絲氨酸酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶(該菌株在mCIM和eCIM聯(lián)合檢測時被誤判為僅產(chǎn)絲氨酸酶)，占0.83%。

2.5碳青霉烯酶耐藥基因檢測結(jié)果 對19株CRKP進(jìn)行blaKPC-2、blaIMP、blaVIM、blaGIM、blaSPM、blaNDM-1、blaOXA-48共7種常見碳青霉烯酶耐藥基因的擴(kuò)增，其中15株檢測出blaKPC-2,3株檢測出blaNDM-1，1株同時檢測出blaNDM-1和blaKPC-2。見圖1。

注：A為部分菌株耐藥基因blaKPC-2的檢測結(jié)果，其中1為陽性對照，2～4為臨床菌株；B為耐藥基因blaNDM-1的檢測結(jié)果，其中5為陽性對照，6～8為臨床菌株。

3 討 論

近年來，由于廣譜抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌耐藥情況日趨嚴(yán)峻。肺炎克雷伯菌感染，尤其是CRKP感染的控制和治療成為臨床重點(diǎn)關(guān)注的問題。肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶、頭孢菌素酶(AmpC)，膜孔蛋白缺失或突變，外排泵過度表達(dá)等。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥最常見的原因是產(chǎn)碳青霉烯酶[6]。Ambler分類法將碳青霉烯酶分為A、B、D 3類,A類酶包括KPC、GES、IMI、SME和SFC，其活性部位含有絲氨酸結(jié)構(gòu)，屬于絲氨酸酶，部分可被克拉維酸抑制；B類酶包括NDM、VIM、SPM、GIM、SIM和IMP，其活性部位含有鋅離子，屬于金屬酶，能被EDTA抑制；D類酶主要包括OXA-48。阿維巴坦可抑制A類和某些D類碳青霉烯酶。

本研究中，CRKP對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率為19.83%，對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為93.07%，該結(jié)果與國內(nèi)同類研究類似[7]；而CRKP對米諾環(huán)素的耐藥率為15.64%，低于同類研究[7]。本研究對121株CRKP進(jìn)行了mCIM和eCIM檢測，產(chǎn)碳青霉烯酶菌株檢出率為83.5%，其中產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株占21.8%，該結(jié)果比其他研究產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢出率(44.83%)高[8]，可能與地區(qū)差異和菌株流行差異有關(guān)。1株同時產(chǎn)絲氨酸酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的CRKP在mCIM和eCIM聯(lián)合檢測時被誤判為僅產(chǎn)絲氨酸酶，而在碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)中，該菌株被準(zhǔn)確檢測出了上述兩種酶。碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確檢測酶型，但除了A類酶和B類酶以外，其不能有效區(qū)分是否產(chǎn)碳青霉烯酶，還是僅為碳青霉烯酶和/或AmpC酶合并膜孔蛋白的下調(diào)或缺失。提示mCIM、eCIM和碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)聯(lián)合使用可能能更準(zhǔn)確地檢測出D類酶[9]。本研究檢測出2種碳青霉烯酶基因blaPKC-2和blaNDM-1，未檢測出blaIMP、blaVIM、blaOXA-48等基因型和變異，可能與檢測的樣本量較少有關(guān)[10]。

肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦敏感，CRKP導(dǎo)致的嚴(yán)重感染也可使用頭孢他啶/阿維巴坦治療。藥敏試驗(yàn)和碳青霉烯酶耐藥基因鑒定對合理使用抗菌藥物具有重要意義。