劉麗珍 甄莉娜 劉文英

摘? ? 要：為了探究大蒜中超氧化物歧化酶的最佳提取條件及提取率，本試驗(yàn)以應(yīng)縣紫皮大蒜為材料，采用雙水相萃取法結(jié)合正交試驗(yàn)，討論P(yáng)EG分子質(zhì)量、PEG濃度、硫酸銨濃度對(duì)大蒜中SOD提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果為：PEG分子量為4000，PEG濃度為25%，硫酸銨濃度為30%時(shí)，雙水相體系的SOD提取率達(dá)到最高為46.9%，影響順序?yàn)镻EG分子質(zhì)量的影響最大，硫酸銨濃度次之，PEG濃度最小，3個(gè)因素對(duì)提取大蒜SOD影響均不顯著。該試驗(yàn)結(jié)果為大蒜SOD的進(jìn)一步分離純化及在工業(yè)化生產(chǎn)、食藥品研究領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：應(yīng)縣紫皮大蒜;SOD;雙水相萃取;正交試驗(yàn);工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S633.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.002

Optimization of Aqueous Two-phase Extraction for SOD in Yingxian Purple Garlic

LIU Lizhen1，2， ZHEN Lina1，2， LIU Wenying1，2

（1.College of Life Science，Shanxi Datong University，Datong， Shanxi 037009， China; 2.Applied Biotechnology Institute， Shanxi Datong University， Datong， Shanxi 037009， China）

Abstract： In order to explore the optimal extraction conditions and extraction yield of superoxide dismutase in garlic， this experiment utilized Yingxian purple garlic as the material and studied the effects of different PEG relative molecular masses， PEG mass fractions， and ammonium sulfate mass fractions on the extraction rate of SOD by using a two-phase extraction method combined with an orthogonal test. These results indicated when? ?the PEG molecular mass of 4000 and concentrations of PEG and ammonium sulfate were 25% and 30% ，respectively， the maximum extraction yield of SOD was 46.9% in the double aqueous phases system. The molecular mass of PEG was the most important factor， followed by ammonium sulfate concentration， and PEG concentration exerted the least influence.These three factors had no significant impact on the extraction of SOD from garlic. These experimental results provided a theoretical basis for further separation and purification of garlic SOD， industrial production，and food and drug research.

Key words： Yingxian purple garlic; SOD; aqueous two-phase; orthogonal test; process optimization

大蒜屬百合科蔥屬植物，《本草綱目》記錄，大蒜祛風(fēng)濕除風(fēng)邪、治吐血和角弓反張、通五臟及大小便、納肛中、散癰腫及霍亂[1-2]。McCord等[3]于1969年在動(dòng)物血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD），是廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，催化O2-自由基歧化，具有消除氧自由基、抗生命氧化衰老、抗輻射抗腫瘤、維持機(jī)體代謝平衡和改善機(jī)體免疫力等作用，在農(nóng)業(yè)、食藥品及化妝品等領(lǐng)域前景廣闊[4-5]。目前我國(guó)主要從動(dòng)物的血液和內(nèi)臟、微生物發(fā)酵和植物中提取SOD。動(dòng)物提取成本高、提取工藝及得到的成分復(fù)雜且不易常溫保存;而植物中大蒜來源及含量極為豐富、生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單，安全性強(qiáng)且含量高[6-7]。值得一提的是，大蒜中的SOD含量及活性是其它植物的數(shù)倍，100 g大蒜中SOD含量高達(dá)17.6 mg，是人體SOD的重要來源之一[8]。

目前，提取純化SOD的方法有雙水相萃取法、超聲波破碎法、熱變性法、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法、硫酸銨分級(jí)鹽析法以及膜分離技術(shù)法[9-10]。相較于其他方法，雙水相技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單，條件適中，回收率高，分相時(shí)間短，無殘留無毒，能耗低，分離過程更快更經(jīng)濟(jì)，提取率高，可連續(xù)化操作[11-12]。

應(yīng)縣本地產(chǎn)紫皮大蒜作為富硒農(nóng)產(chǎn)品，被譽(yù)為“天然抗生素”。本研究以紫皮大蒜為原料，利用雙水相體系萃取法結(jié)合正交試驗(yàn)法，優(yōu)化了SOD提取工藝并檢測(cè)其含量和提取率，并旨在為大蒜SOD的進(jìn)一步分離純化及在工業(yè)化生產(chǎn)以及食藥品研究領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫皮大蒜（山西省農(nóng)科院高寒作物研究所提供），牛超氧化物歧化酶對(duì)照品、PEG400、PEG600、PEG1 000、PEG4 000、PEG6 000、（NH4）2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4以及考馬斯亮藍(lán)G-250等為分析純，均購(gòu)于試劑公司。

1.2 主要儀器

H1850R型高速冷凍離心機(jī)，由湖南湘儀儀器有限公司生產(chǎn);XFB-200型粉碎機(jī)，由吉首中誠(chéng)制藥機(jī)械廠生產(chǎn);JA5003A型電子天平，由上海精科天美儀器有限公司生產(chǎn);UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)，由上海美普達(dá)公司生產(chǎn);SK-1型渦旋混勻器，由江蘇科析有限公司生產(chǎn);PH-3C型酸度計(jì)，由上海儀電科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜的選取 選用瓣肉白、無蟲害、無霉變、無破損的大蒜500 g，去皮去蒂后用無菌水洗凈晾干，粉碎后轉(zhuǎn)至潔凈研缽中磨碎成泥狀。

1.3.2 粗提液的提取 將1.3.1 的蒜泥分5份，按1∶2加pH7.8的磷酸緩沖液（0.05 mol·L-1）研磨，待SOD完全溶解后5 000 rpm離心10 min，去掉不溶性雜質(zhì)取上清，緩沖液繼續(xù)浸泡雜質(zhì)，反復(fù)3次合并提取液，5層紗布過濾得到粗提液。

1.3.3 建立雙水相體系 以1.3.2 粗提液為原料，于15 mL離心管中加入不同分子質(zhì)量PEG，分別和（NH4）2SO4搖勻，3 500 rpm離心10 min，4 ℃靜置2 h待分層，測(cè)定上、下相中SOD的濃度。

1.3.4 大蒜SOD含量的測(cè)定

（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取牛SOD對(duì)照品10 mg（0.1 mg·mL-1），稀釋成50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5 mg·mL-1等6個(gè)不同梯度及對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照，595 nm 處測(cè)定吸光值，重復(fù)3次，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫縱坐標(biāo)分別為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（P，m·V-1）和其吸光度，回歸方程為Y=41.574X+0.236 9，R2=0.997 5。

（2）考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定SOD的含量

SOD的含量采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法[13]。取干凈的15 mL離心管15支，樣品管3支，標(biāo)準(zhǔn)管和空白管各1支，做3個(gè)重復(fù)。依次對(duì)應(yīng)加0.1 mL樣品液、0.1mL標(biāo)準(zhǔn)液、0.1 mL生理鹽水和 5 mL考馬斯亮藍(lán)，混合完全后測(cè)其吸光度，重復(fù)3次。計(jì)算方法如下：

式中， Vs為雙水相體系中上相的體積，mL;VX為雙水相體系中下相的體積，mL;CS為雙水相體系上相SOD的濃度，mg·mL-1;CX為雙水相體系下相SOD的濃度，mg·mL-1。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

（1）PEG分子質(zhì)量對(duì)大蒜SOD提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蒜泥50 g，選取濃度為20%的PEG和25%的（NH4）2SO4組成體系溶液，設(shè)定PEG的分子質(zhì)量為200，400，600，1 000，4 000，6 000。觀察不同PEG分子質(zhì)量對(duì)大蒜SOD提取率的影響。

（2）PEG濃度對(duì)大蒜SOD提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蒜泥50 g，選取PEG4 000和25%的（NH4）2SO4組成體系溶液，設(shè)定PEG濃度為10%，15%，20%，25%，30%，35%。觀察不同濃度PEG對(duì)大蒜SOD提取率的影響。

（3）（NH4）2SO4濃度對(duì)大蒜SOD提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蒜泥50 g，選取分子質(zhì)量為4 000，濃度為20%的PEG，設(shè)定（NH4）2SO4濃度為5%，10%，15%，20%，25%，30%組成體系溶液。觀察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 （NH4）2SO4對(duì)大蒜SOD提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 PEG分子質(zhì)量對(duì)大蒜SOD提取率的影響 由圖1可知，大蒜SOD的提取率隨著PEG相對(duì)分子質(zhì)量的不斷增大而升高，PEG分子質(zhì)量為4 000時(shí)，大蒜SOD的提取率最大為42.3%，之后PEG分子質(zhì)量繼續(xù)加大，大蒜SOD的提取率反而下降?？赡苁蔷酆衔锓肿恿康脑黾哟龠M(jìn)了酶在兩相間的傳遞，當(dāng)分子量增加到一定程度時(shí)，由于高聚物分子體積排斥作用的結(jié)果[14]，反而阻礙其傳遞，導(dǎo)致提取率下降。因此在進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，分別選取PEG分子質(zhì)量為1 000，4 000，6 000做3個(gè)水平。

2.1.2 PEG濃度對(duì)大蒜SOD提取率的影響 由圖2可知，大蒜SOD的提取率隨著PEG4 000濃度的不斷加大而提高，濃度為20%時(shí)提取率為最大值43.9%，之后繼續(xù)加大PEG濃度，SOD的萃取率反而下降?？赡苁荘EG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，下相的鹽析作用占主導(dǎo)，隨著PEG濃度的繼續(xù)增加，SOD主要分配在富含PEG的上相中，導(dǎo)致SOD的提取率不斷上升[14]，濃度上升到一定程度時(shí)，提取率開始下降。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取PEG4 000的濃度分別為15%，20%，25%進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.3 （NH4）2SO4濃度對(duì)大蒜SOD提取率的影響 由圖3可知，隨著（NH4）2SO4濃度的增加，大蒜SOD的提取率在不斷上升，濃度為25%時(shí)，提取率達(dá)到最大值38.1%，之后繼續(xù)加大（NH4）2SO4濃度，SOD的提取率反而下降。可能的原因是隨著（NH4）2SO4濃度的增大，對(duì)水分子的爭(zhēng)奪致下相體積增大，上相PEG的濃度相對(duì)增加，SOD的萃取率也相應(yīng)增加[15]，當(dāng)（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定程度時(shí)，提取率開始下降。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選?。∟H4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，25%，30%進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以PEG分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察因素，以大蒜SOD提取率為指標(biāo)，選擇3因素3水平做正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

由表2可知，提取大蒜SOD的最佳組合為A2B3C3，即PEG分子量為 4 000，PEG濃度為25%，（NH4）2SO4濃度為30%時(shí)，大蒜SOD的提取率最大。由極差值R得出，雙水相法萃取大蒜SOD的影響順序?yàn)锳 >C >B，即PEG分子質(zhì)量的影響最大，（NH4）2SO4濃度次之，PEG濃度最小。最優(yōu)組合經(jīng)驗(yàn)證，得出的提取率為46.9%。

由表 3可以得出，雙水相法提取大蒜SOD的 3個(gè)因素對(duì)SOD的提取率影響不顯著。

3 結(jié)論與討論

SOD作為生物體的首要清除劑，反應(yīng)生物體的抵抗能力[16]，天然植物大蒜中SOD的含量較為豐富，廣泛應(yīng)用于食藥品、農(nóng)醫(yī)等領(lǐng)域[17]。本試驗(yàn)運(yùn)用雙水相萃取法提取應(yīng)縣紫皮大蒜中的SOD，根據(jù)正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果得出的最佳條件：PEG分子量為4 000，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，（NH4）2SO4濃度為30%時(shí)，SOD的提取率最高，達(dá)46.9%。影響順序?yàn)镻EG分子質(zhì)量的影響最大，（NH4）2SO4濃度次之，PEG濃度最小，3個(gè)因素對(duì)提取大蒜SOD影響均不顯著。這與張麗華等[14]的研究一致，可能是由于超氧化物歧化酶在兩相中擴(kuò)散及兩相間傳遞的阻力隨著高聚物分子量的增大而變大，體積排斥作用的加大阻礙酶進(jìn)入富含PEG的相中而轉(zhuǎn)向另一相。而高聚物分子量越小，提取液在兩相間的分配系數(shù)越大，越易分配到富含該聚合物的相中[15]。

謝芳等[15]的研究結(jié)果表明，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，下相的鹽析作用占主導(dǎo)，使SOD主要分配在富含PEG的上相。隨著雙水相體系中上相PEG濃度的增加，表面的張力加大，脂溶性成分的溶出，加劇了溶質(zhì)的傳遞及擴(kuò)散阻力，抑制了SOD進(jìn)入上相而導(dǎo)致SOD萃取減少。（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大對(duì)水分子的爭(zhēng)奪致下相體積增大，上相PEG的濃度相對(duì)增加，SOD的萃取率也相應(yīng)增加。（NH4）2SO4濃度太高或太低時(shí)，此雙水相萃取系統(tǒng)均不能成相。太低時(shí)， PEG和（NH4）2SO4出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象，SOD易分配到下相;太高時(shí)，出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，SOD易分配到上相[15，18]?？煽康脑囼?yàn)結(jié)果，可以大規(guī)模地開發(fā)、生產(chǎn)大蒜 SOD 的附加產(chǎn)品，增加大蒜的綜合利用價(jià)值，提高大蒜的附加值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，為大蒜SOD的分離純化等進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

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