貴州三穗特色黃皮蛋加工過程中凝膠形成及顏色變化分析

于 沛，王修俊,，徐 雯，劉林新，楊麗平，陳顏紅，聶黔麗，楊萬云，姚碧瓊

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.三穗縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 三穗 556500）

皮蛋是在強(qiáng)堿溶液中腌制而成的風(fēng)味蛋制品，民間俗稱松花蛋、變蛋。傳統(tǒng)皮蛋腌制工藝中常采用氧化鉛作為腌制劑，其易引發(fā)重金屬含量超標(biāo)、堿味過重等食品安全問題[1-2]。與此同時(shí)，傳統(tǒng)皮蛋多為暗黑色或墨綠色，在視覺上易使消費(fèi)者產(chǎn)生排斥感。目前主要通過改善傳統(tǒng)工藝提高皮蛋品質(zhì)及安全性。前期本課題組通過預(yù)實(shí)驗(yàn)探究了以硫酸銅與硫酸鋅復(fù)配液代替氧化鉛作為腌制液的可行性，在15 ℃條件下，利用銅-鋅復(fù)配質(zhì)量比1∶2、銅-鋅復(fù)配液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的無鉛腌制配方，腌制18 d可得到色澤金黃、品質(zhì)優(yōu)良的皮蛋。皮蛋蛋清的凝膠質(zhì)構(gòu)及色澤是判斷其品質(zhì)的重要指標(biāo)，為更好地改進(jìn)皮蛋腌制技術(shù)，提高產(chǎn)品品質(zhì)，有必要研究皮蛋加工過程中的獨(dú)特的凝膠質(zhì)構(gòu)及顏色變化機(jī)理。Ji Ling等[3]對皮蛋化清期的化學(xué)力及蛋白結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，皮蛋化清期蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化明顯，說明皮蛋腌制凝膠前期蛋內(nèi)發(fā)生了極為復(fù)雜的物理、化學(xué)變化。涂勇剛等[4]對皮蛋加工過程中的蛋白與蛋黃進(jìn)行流變性及質(zhì)構(gòu)特性測定，結(jié)果表明加工過程中蛋黃凝膠的硬度呈先增大后基本保持不變的趨勢。在色澤形成機(jī)理方面，趙燕等[5]分析認(rèn)為皮蛋蛋白顏色的變化主要由羰氨反應(yīng)造成。目前有關(guān)研究主要針對傳統(tǒng)方法腌制的皮蛋，而對于無鉛腌制工藝條件下的黃皮蛋蛋清凝膠形成及顏色變化機(jī)制方面的研究少有涉及。

為使無鉛腌制工藝更好地應(yīng)用于生產(chǎn)健康、品質(zhì)優(yōu)良的黃皮蛋，促進(jìn)皮蛋產(chǎn)業(yè)發(fā)展，本研究以三穗麻鴨蛋為原料，以預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的黃皮蛋最佳無鉛腌制工藝為基礎(chǔ)，對黃皮蛋腌制和后熟過程中的質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)和分子間作用力等凝膠特性及顏色變化進(jìn)行分析，探究黃皮蛋無鉛加工過程中蛋清凝膠及顏色形成機(jī)理及關(guān)鍵控制點(diǎn)，以期為黃皮蛋無鉛腌制技術(shù)實(shí)際應(yīng)用提供更全面的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三穗鮮麻鴨蛋 三穗縣翼羽鴨業(yè)公司；紅茶沫貴州大學(xué)吉林村農(nóng)貿(mào)市場。

氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鋅、磺基水楊酸、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、鹽酸、尿素 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；氯化鈉（食品級） 貴州省貴陽市花溪區(qū)合力超市；Tris-HCl 北京Solarbio科技有限公司；溴化鉀（光譜級）、乙醇、冰乙酸、戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì) 上海鴻蓋儀器有限公司；XHF-D高速勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TMS Pro質(zhì)構(gòu)儀 北京盈盛恒泰科技責(zé)任有限公司；16K高速離心機(jī) 德國西格瑪公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；Varioskan Falsh多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；HP-2136色差儀上海臨嘉科教儀器有限公司；Nexus470型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 皮蛋樣品制備

鮮鴨蛋（質(zhì)量約70 g）→洗凈晾干→配制腌制液→15 ℃恒溫腌制→取樣

黃皮蛋腌制體系為m（腌制液）∶m（鮮蛋）＝1∶1。按所配制腌制液總質(zhì)量計(jì)，分別稱取NaOH 4.0%、硫酸銅0.13%、硫酸鋅0.27%、紅茶3%、食鹽4%。

腌制與取樣：皮蛋置于腌制液中15 ℃恒溫腌制18 d，腌制結(jié)束后取出洗凈蛋體表面腌制劑，繼續(xù)置于常溫條件下放置。期間每6 d取樣一次進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定，以對皮蛋加工過程進(jìn)行分析研究，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行30 d。

1.3.2 皮蛋蛋清游離堿度的測定

參考GB/T 5009.47—2003《蛋與蛋制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[6]的方法測定黃皮蛋蛋清游離堿度（以NaOH計(jì)）。

1.3.3 皮蛋蛋清凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考Handa等[7]的方法進(jìn)行，將加工過程中皮蛋蛋清凝膠部分切成0.5 cm×0.5 cm薄片，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定12 h，再用體積分?jǐn)?shù)60%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每次10 min，脫水完成后采用冷凍干燥法將樣品完全干燥，最后利用掃描電子顯微鏡觀察蛋清凝膠微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.4 皮蛋蛋清凝膠分子間作用力的測定

根據(jù)Zhao Yan等[8]的方法并作適當(dāng)修改，根據(jù)凝膠樣品在不同組合變性劑中的溶解度來確定各種化學(xué)鍵的作用力。分別稱取4 份0.3 g皮蛋蛋清粉碎樣品并與10 mL A、B、C、D 4 種溶液混合（A溶液為0.6 mol/L NaCl，B溶液為0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L尿素、C溶液為0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素、D溶液為0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/Lβ-巰基乙醇）。搖勻后用分散器10 000 r/min均質(zhì)1 min，然后在4 000 r/min下離心20 min。采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。其中，以溶解于A溶液中蛋白質(zhì)量濃度表示離子鍵作用力；以溶解于A、B溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差表示氫鍵作用力；以溶解于B、C溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差表示疏水作用；以溶解于C、D溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差表示二硫鍵作用力。

1.3.5 皮蛋蛋清凝膠傅里葉變換紅外光譜分析

取加工0～30 d的皮蛋，分開蛋黃和蛋清，將蛋清凍干后粉碎成粉末狀備用。取蛋清樣品1 mg，加150 mg溴化鉀混合后，研磨壓制成薄圓片，進(jìn)行FTIR掃描，每個(gè)樣品掃描前均進(jìn)行溴化鉀背景扣除。波數(shù)范圍為4 000～400 cm－1、掃描次數(shù)為16 次、分辨率為4 cm－1。每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，選取效果較好的譜圖進(jìn)行后續(xù)處理。測試完成的圖譜利用Omnic 8.0軟件進(jìn)行自動(dòng)基線校正，進(jìn)行傅里葉去卷積和二階導(dǎo)數(shù)處理，然后利用Origin 8.0軟件中高斯函數(shù)多次擬合二階導(dǎo)數(shù)譜和傅里葉去卷積譜至殘差值最小，選定各子峰的峰位，使重疊的不同譜帶完全分開。確定各子峰強(qiáng)度和不同蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其峰面積計(jì)算各種二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.6 皮蛋蛋清凝膠質(zhì)構(gòu)特性測定

取皮蛋蛋清頭部凝膠（1 cm×1 cm×1 cm），置于TMS Pro質(zhì)構(gòu)儀基臺(tái)中心，采用TPA測定模式，測定參數(shù)：測試速率60 mm/min，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載0.15 N，循環(huán)次數(shù)2，形變量70%。硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性由儀器配套軟件分析得到。每組樣品平行測定6 次。

1.3.7 皮蛋蛋清凝膠色差測定

將皮蛋切成1 cm×1 cm×1 cm的立方體，室溫下用色差儀測定樣品色度。其中L值為亮度，其值0～100表示從全黑至全白；a值（紅綠度）由負(fù)到正表示綠色至紅色；b值（黃藍(lán)度）由負(fù)到正表示藍(lán)色至黃色。白度W值按下式計(jì)算。

1.3.8 皮蛋蛋清凝膠還原糖含量的測定

參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》[9]的方法測定皮蛋蛋清凝膠還原糖含量。

1.3.9 皮蛋蛋清凝膠游離氨基酸含量的測定

采用氨基酸自動(dòng)分析儀法測定皮蛋蛋清凝膠游離氨基酸含量，準(zhǔn)確稱取1.00 g皮蛋蛋清粉碎樣品，用50 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液浸提30 min；搖勻后過濾，準(zhǔn)確吸取濾清液2 mL于離心試管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%磺基水楊酸溶液2 mL，混勻，靜置15 min；3 000 r/min離心20 min；取上清液，過0.22 μm有機(jī)膜后上機(jī)。檢測條件：脯氨酸含量在440 nm波長處測定，其余氨基酸含量在570 nm波長處測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 24.0軟件中方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著）；采用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮蛋加工過程中蛋清游離堿度的變化

如圖1所示，腌制過程中（0～18 d），隨著加工時(shí)間延長，蛋清游離堿度逐漸增加，增長速率呈先快后慢的趨勢，從初始的47.59 mg/100 g增加至466.59 mg/100 g，腌制結(jié)束（18 d）后，蛋體離開腌制液強(qiáng)堿環(huán)境，蛋清游離堿度逐漸下降至24 d時(shí)的323.53 mg/100 g，在24～30 d，皮蛋蛋清游離堿度變化不明顯。

圖1 皮蛋加工過程中蛋清游離堿度變化Fig. 1 Change in free alkalinity of egg white during the processing of preserved eggs

游離堿度是影響皮蛋加工形成的重要因素[10]，皮蛋腌制初期，腌制堿液破壞蛋殼及殼膜，逐漸向蛋內(nèi)滲透，使蛋體內(nèi)游離堿度不斷增加。隨著腌制時(shí)間延長，蛋清與腌制液的堿度逐漸平衡，蛋內(nèi)堿度上升速率減緩。18 d后皮蛋腌制完成取出，由于蛋清與蛋黃的游離堿度存在濃度差，蛋清內(nèi)游離堿繼續(xù)向蛋黃內(nèi)滲透，同時(shí)蛋清中部分蛋白質(zhì)降解并結(jié)合蛋清中游離堿，使蛋清游離堿度逐漸下降。24 d后，蛋清與蛋黃的游離堿度差逐漸減小，蛋清游離堿度趨于穩(wěn)定。

2.2 皮蛋加工過程中蛋清凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化

掃描電子顯微鏡能利用二次電子信號成像來觀察樣品的表面形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。0～18 d皮蛋腌制過程中，蛋清蛋白逐漸從粗毛孔無序狀態(tài)變?yōu)橛行虻娜S網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，且規(guī)則地分布有疏松網(wǎng)孔。從圖2A、B可觀察到，0～6 d時(shí)，皮蛋處于流動(dòng)態(tài)液體，蛋白質(zhì)無序排列；如圖2C所示，12 d時(shí)，皮蛋蛋清凝膠化，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)孔緊密、結(jié)構(gòu)牢固，與文獻(xiàn)[11]觀察到的結(jié)果相似；18 d時(shí)，蛋清凝膠部分被堿破壞，網(wǎng)孔變大（圖2D）；24～30 d時(shí)，皮蛋離開腌制堿液環(huán)境，蛋清凝膠自我修復(fù)，網(wǎng)孔變得緊密、結(jié)構(gòu)變得牢固，彈性、硬度增大，形成較好的抗外力特性（圖2E、F）。分析造成上述結(jié)果的原因可能是，皮蛋腌制液中強(qiáng)堿環(huán)境使皮蛋蛋白pH值遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，促使皮蛋蛋白逐漸形成線性纖維狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[12]。同時(shí)腌制液的強(qiáng)堿作用使蛋內(nèi)分子間作用力發(fā)生變化，蛋白間通過共價(jià)鍵相互作用，可自由連接組合，聚集形成纖維狀的蛋白聚集體或超分子結(jié)構(gòu)[13]。為進(jìn)一步探究皮蛋加工過程中蛋清凝膠變化過程，下面對皮蛋加工過程中分子間作用力及凝膠質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行檢測分析。

圖2 皮蛋加工過程中蛋清微觀結(jié)構(gòu)變化Fig. 2 Microstructure changes of egg white during the processing of preserved eggs

2.3 皮蛋加工過程中蛋清凝膠分子間作用力變化

維持蛋清凝膠結(jié)構(gòu)的分子間相互作用力能夠在特定變性溶劑下被打開[14]，故能夠以不同變性劑中蛋白質(zhì)的溶解度反映相應(yīng)分子間作用力，從而分析皮蛋加工過程中分子間不同作用力的變化情況[15]。皮蛋加工過程中分子間作用力變化結(jié)果如表1所示。

表1 皮蛋加工過程中蛋清分子間作用力變化Table1 Changes in intermolecular forces in egg white during the processing of preserved eggs

如表1所示，蛋清凝膠分子間作用力有明顯差異，且隨著皮蛋的腌制時(shí)間延長而發(fā)生相應(yīng)變化。腌制0～6 d過程中，離子鍵作用力、疏水作用、二硫鍵作用力顯著增加，且在12～30 d凝膠形成后，蛋清中離子鍵作用力均大于23 mg/100 g，二硫鍵作用力均大于20 mg/100 g，氫鍵作用力均小于4 mg/100 g，疏水作用均小于15 mg/100 g；離子鍵與二硫鍵作用力占總作用力的70%以上，離子鍵作用力占總作用力的36%以上，二硫鍵作用力占總作用力的33%以上，疏水作用占總作用力的25%以下，氫鍵作用占總作用力的6%以下。結(jié)果表明，氫鍵在維持皮蛋凝膠結(jié)構(gòu)中作用較小，離子鍵和二硫鍵對維持皮蛋凝膠結(jié)構(gòu)作用較大，同時(shí)疏水作用也對皮蛋凝膠結(jié)構(gòu)有一定影響。

結(jié)合表1和蛋清的微觀結(jié)構(gòu)變化結(jié)果可知，皮蛋凝膠含有大量的離子鍵和一定數(shù)量的二硫鍵。離子鍵種類一般包括兩性離子靜電吸引力、鹽橋和水-離子鍵[16]。離子鍵主要受負(fù)電荷影響，過多的離子鍵不利于皮蛋凝膠的形成[17]。在高堿度環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子表面會(huì)有凈負(fù)電荷，導(dǎo)致基團(tuán)之間產(chǎn)生靜電斥力，降低了蛋白質(zhì)分子的可聚集性，但是腌制液中添加的銅離子在一定程度上減弱了表面負(fù)電荷對蛋白質(zhì)分子的排斥力[18]，有利于蛋白質(zhì)分子的聚集。

皮蛋腌制初期，腌制堿液快速向蛋內(nèi)滲透，蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷數(shù)量迅速增加，使離子鍵含量增加，第6天之后，腌制堿液滲透速率降低，且伴隨著腌制液中氯化鈉的逐漸滲入，蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷相互作用減小，離子鍵含量降低，與文獻(xiàn)[19]的研究結(jié)果一致。離子鍵對維持皮蛋凝膠結(jié)構(gòu)具有重要作用。二硫鍵是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要次級鍵，在一定條件下，二硫鍵與巰基能相互轉(zhuǎn)換[20]，在皮蛋加工過程中，腌制堿液的強(qiáng)堿作用使皮蛋蛋白變性，多肽鏈中的巰基逐漸轉(zhuǎn)化為二硫鍵，促進(jìn)了蛋白質(zhì)凝膠的形成。氫鍵和疏水作用也對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有一定的作用[21]，皮蛋加工過程中，蛋內(nèi)氫鍵、疏水作用、二硫鍵等作用力總體逐漸增強(qiáng)，與離子鍵共同作用于皮蛋蛋清凝膠，使蛋白結(jié)構(gòu)更為緊密。

2.4 皮蛋加工過程中蛋清凝膠質(zhì)構(gòu)特性變化

結(jié)合黃皮蛋加工過程中的化學(xué)鍵作用力可知，在加工前6 d，離子鍵與二硫鍵作用力迅速增加，蛋清處于化清狀態(tài)，黏度明顯下降。分析原因?yàn)槠さ半缰瞥跗谔幱诟邼舛葔A液中，蛋清游離堿度迅速升高，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞，且高pH值條件下蛋白質(zhì)分子表面會(huì)產(chǎn)生大量凈負(fù)電荷，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體間產(chǎn)生靜電斥力，靜電斥力抑制蛋白質(zhì)相互作用[22]，從而阻止凝膠的形成。在加工第6天時(shí)，皮蛋蛋清處于化清態(tài)，未形成皮蛋凝膠，故未對其進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測定。

第12～30天皮蛋蛋清質(zhì)構(gòu)變化如圖3所示，皮蛋加工過程中，蛋清凝膠質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)水平不斷變化，第12天時(shí)，皮蛋蛋清硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性、內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)特性水平均較高，蛋清硬度為17.24 N、內(nèi)聚性為0.86、彈性為5.03 mm、膠黏性為14.9 N、咀嚼性為74.58 mJ，蛋清呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)。分析原因可能是腌制液中氯化鈉的滲入使蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷相互作用減小，有利于蛋白質(zhì)分子的聚集，此時(shí)的二硫鍵作用力較高，二硫鍵可提高蛋白質(zhì)抵抗外界因素的能力，蛋白質(zhì)凝膠穩(wěn)定性加強(qiáng)。12～18 d凝膠質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)水平下降，分析原因?yàn)殡缰埔褐械穆然c濃度低于堿液濃度，蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷較多，使凝膠強(qiáng)度降低，此階段離子鍵作用力持續(xù)下降，研究表明，二硫鍵是維持鴨蛋凝膠的主要作用力[23]。18 d后，黃皮蛋離開腌制液，凝膠質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)水平均明顯上升，此時(shí)蛋白質(zhì)分子間靜電吸引力起主導(dǎo)作用，蛋清堿度逐漸降低，使皮蛋凝膠在一定程度上自我修復(fù)，皮蛋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈發(fā)牢固，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)愈發(fā)緊密，形成較好的抗外力特性，故表現(xiàn)較高的質(zhì)構(gòu)特性水平[24]。結(jié)合表1與圖3可知，加工18～24 d，蛋白質(zhì)分子間化學(xué)鍵作用力變化不明顯，皮蛋凝膠各質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)上升并逐漸趨于平衡狀態(tài)，在24～30 d時(shí)，皮蛋蛋清質(zhì)構(gòu)特性無明顯差異，此時(shí)蛋白質(zhì)離子鍵與二硫鍵作用力約占總作用力的70%，以離子鍵與二硫鍵為主的凝膠結(jié)構(gòu)為不可逆凝膠[25]，促使黃皮蛋形成穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)。

圖3 皮蛋加工過程中蛋清凝膠質(zhì)構(gòu)特性變化Fig. 3 Changes in gel texture properties of egg while proteins during the processing of preserved eggs

綜上，蛋清凝膠主要形成于6～12 d，質(zhì)構(gòu)特性變化主要集中于12～24 d，在加工24 d后，蛋清質(zhì)構(gòu)特性基本穩(wěn)定，質(zhì)構(gòu)特性水平隨時(shí)間延長無明顯變化。即在實(shí)際生產(chǎn)中，皮蛋腌制完成后，可常溫放置6 d，蛋清凝膠性質(zhì)會(huì)略微提升，產(chǎn)品品質(zhì)更佳。

2.5 皮蛋加工過程中蛋清蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化

如圖4所示，蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺I帶的吸收峰主要是由蛋白質(zhì)骨架中的羰基振動(dòng)引起，能夠直觀、靈敏地反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其變化，因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量的變化來確定蛋白質(zhì)的變性情況[26]。蛋白質(zhì)在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）的信號較強(qiáng)，主要是C＝O肽鏈伸縮振動(dòng)、N－H彎曲振動(dòng)和C－N伸縮振動(dòng)的耦合所引起[27]，加工過程中的黃皮蛋均在1 640 cm－1左右有最大的吸光度，說明黃皮蛋凝膠結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)的相對含量較高。對FTIR圖傅里葉去卷積后進(jìn)行高斯函數(shù)分峰擬合可得圖5。

圖4 黃皮蛋加工過程中蛋清的FTIR圖Fig. 4 Changes in Fourier transform infrared spectra of egg white proteins during the processing of yellow preserved eggs

圖5 黃皮蛋加工過程中蛋清的高斯曲線擬合圖Fig. 5 Gauss curve fitting of Fourier transform infrared spectra of egg white proteins during the processing of yellow preserved eggs

利用酰胺I帶中各子峰的面積積分占比表示各個(gè)二級結(jié)構(gòu)相對含量。酰胺I帶的各子峰所對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的波數(shù)范圍：1 600～1 640 cm－1為β-折疊、1 640～1 650 cm－1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)、1 650～1 658 cm－1為α-螺旋、1 660～1 700 cm－1為β-轉(zhuǎn)角[28]。如表2所示，未開始腌制的新鮮鴨蛋蛋白二級結(jié)構(gòu)中以α-螺旋和β-折疊為主，相對含量分別為34.59%、32.51%。腌制階段的18 d內(nèi)，α-螺旋相對含量逐漸降低，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量明顯增加，故可推斷黃皮蛋在腌制過程中，蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿環(huán)境中發(fā)生變性，二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋氫鍵斷裂，向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化。且α-螺旋和β-折疊含量在腌制的0～12 d過程中變化的速率較快，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有助于蛋白質(zhì)分子的聚集。腌制12～18 d，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化相對不明顯，但無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量降低，這與凝膠結(jié)構(gòu)在強(qiáng)堿腌制液中被破壞有關(guān)。黃皮蛋在18 d后離開腌制液，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定，結(jié)合質(zhì)構(gòu)變化分析可知，24～30 d凝膠質(zhì)構(gòu)趨于穩(wěn)定，30 d時(shí)β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量分別為35.84%和29.12%，故黃皮蛋加工完成后維持凝膠的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。

表2 黃皮蛋加工過程中蛋清蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化Table2 Changes in protein secondary structures of egg white during the processing of yellow preserved eggs

2.6 皮蛋加工過程中蛋清色澤變化

如圖6所示，皮蛋加工過程中，皮蛋蛋清W值和L值呈下降趨勢，a值和b值呈上升趨勢，蛋清由白色逐漸變成金黃色。12～18 d時(shí)，蛋清色差變化幅度最大，隨后色差變化幅度減小，24～30 d時(shí)，蛋清b、L、W值變化不明顯。蛋清色澤變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，目前較為認(rèn)可的變色反應(yīng)是羰氨反應(yīng)。

圖6 皮蛋加工過程中蛋清色差變化Fig. 6 Color changes of egg white during the processing of preserved eggs

2.7 皮蛋加工過程中蛋清內(nèi)還原糖含量變化

由圖7所示，皮蛋加工過程中，蛋清內(nèi)還原糖含量總體呈下降趨勢，下降趨勢先急后緩，從最初的0.58 g/100 g逐漸降低到30 d時(shí)的0.19 g/100g，腌制12 d后還原糖含量趨于穩(wěn)定。

圖7 皮蛋加工過程中蛋清還原糖含量變化Fig. 7 Changes in reducing sugar content of egg white during the processing of preserved eggs

羰氨反應(yīng)本質(zhì)上是羰氨間的縮合反應(yīng)，能夠生成大量類黑色色素前體物質(zhì)，色素前體物質(zhì)大量積累并發(fā)生褐變，最終生成類黑色色素[29]。鮮鴨蛋中豐富的還原糖為羰氨反應(yīng)提供了羰基化合物。皮蛋加工過程中，羰氨反應(yīng)不斷進(jìn)行，逐漸消耗蛋清中還原糖，羰基化合物濃度降低，羰氨反應(yīng)速率逐漸降低，故還原糖含量下降趨勢減緩。

結(jié)合皮蛋加工過程中蛋清顏色變化過程，0～12 d時(shí)，蛋清內(nèi)還原糖含量快速降低，12～18 d時(shí)，蛋清W、L值逐漸下降，a和b值逐漸升高，蛋清顏色逐漸變黃變暗。上述結(jié)果證實(shí)羰氨反應(yīng)與皮蛋色澤變化有關(guān)。在18～30 d時(shí)，皮蛋離開腌制堿液環(huán)境，蛋清顏色逐漸穩(wěn)定，所以24～30 d時(shí)，蛋清b、L、W值均無明顯差異。

2.8 皮蛋加工過程中蛋清內(nèi)游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸為羰氨反應(yīng)提供氨基，促使皮蛋色澤發(fā)生改變。為探究游離氨基酸對皮蛋色澤形成的貢獻(xiàn)，對皮蛋加工過程中蛋清內(nèi)游離氨基酸含量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表3。

表3 皮蛋加工過程中游離氨基酸含量變化Table3 Changes in the contents of free amino acids in egg white during the processing of preserved eggs

由表3可知，皮蛋加工過程中游離氨基酸種類逐漸增加，從最初的8 種增長到結(jié)束時(shí)的13 種；游離氨基酸總含量先減少后持續(xù)增加，從初始的31.67 mg/100 g降為6 d時(shí)的26.51 mg/100 g，隨后一直上升至結(jié)束時(shí)的106.27 mg/100 g。隨時(shí)間延長，皮蛋內(nèi)不同游離氨基酸含量發(fā)生顯著變化。

皮蛋加工過程中，蛋內(nèi)游離氨基酸含量變化是一個(gè)較為復(fù)雜的過程，一方面蛋白質(zhì)、多肽等在腌制堿液作用下分解為游離氨基酸[30]；另一方面，游離氨基酸在堿作用下發(fā)生氧化、脫氨和羰氨反應(yīng)，消耗蛋內(nèi)游離氨基酸[31]。所以皮蛋加工過程中蛋內(nèi)游離氨基酸變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程。腌制初期，蛋內(nèi)游離氨基和羰基化合物發(fā)生羰氨反應(yīng)，故0～6 d時(shí)，羰氨反應(yīng)快速進(jìn)行，總游離氨基酸含量顯著降低。隨著反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)物濃度降低，羰氨反應(yīng)速率減慢，同時(shí)腌制堿液持續(xù)作用使蛋白質(zhì)分解為游離氨基酸，故第6天后，總游離氨基酸含量開始持續(xù)上升。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，黃皮蛋蛋清凝膠結(jié)構(gòu)及色澤形成主要在腌制階段的6～12 d，此階段是控制皮蛋品質(zhì)的關(guān)鍵階段。在第12天時(shí)，皮蛋蛋清硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性、內(nèi)聚性等質(zhì)構(gòu)特性均達(dá)到較大值，腌制12～18 d，離子鍵作用力及質(zhì)構(gòu)特性水平呈下降趨勢，蛋清凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，α-螺旋結(jié)構(gòu)與β-折疊、β-轉(zhuǎn)角相對含量變化不大，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量下降至8.07%。18 d后為黃皮蛋的后熟階段，蛋清凝膠結(jié)構(gòu)、質(zhì)構(gòu)特性趨于穩(wěn)定，加工24 d后，蛋清凝膠質(zhì)構(gòu)特性基本穩(wěn)定，質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)水平隨時(shí)間延長無明顯變化。維持蛋清蛋白質(zhì)凝膠的分子間作用力從強(qiáng)到弱依次是是離子鍵、二硫鍵、疏水作用、氫鍵，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要是β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。

蛋清顏色變化主要由羰氨反應(yīng)調(diào)控，其與蛋清內(nèi)還原糖及游離氨基酸含量變化有關(guān)。色澤形成階段主要集中于腌制的0～12 d，此時(shí)蛋清內(nèi)還原糖含量快速降低，游離氨基酸含量先降低后升高；隨后，蛋清白度、亮度逐漸下降，紅綠度和黃藍(lán)度逐漸升高，蛋清顏色逐漸變黃變暗。綜上，在實(shí)際生產(chǎn)中，皮蛋腌制完成后，可常溫放置6 d，蛋清凝膠性質(zhì)會(huì)略微提升，色澤穩(wěn)定，產(chǎn)品品質(zhì)更佳。