陳寧，黃權(quán)華，李婷，李平飛，于紅，皮玲琳，楊星鋼，楊戰(zhàn)鏖*（. 深圳華潤九新藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 58000；. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 006）

近年來，光熱治療（photothermal therapy，PTT）因腫瘤選擇性強，不良反應(yīng)少而被廣泛研究[1-3]。PTT作為一種非侵入性的治療方法，可用于高齡或同時患有其他疾病的患者，提高患者的順應(yīng)性[4]；此外，PTT具有不良反應(yīng)少、高度特異性、不易產(chǎn)生多藥耐藥性、可重復(fù)治療等優(yōu)點[5-6]。

PTT的重點就在于選擇合適的光熱材料。吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）作為近紅外有特征吸收峰的有機三碳花菁染料，具有較高的光熱轉(zhuǎn)換率[7]，且升溫迅速，ICG在激光照射下可迅速升溫并殺死腫瘤細胞[8-9]。然而，ICG的臨床應(yīng)用也存在致命的缺陷，其體內(nèi)半衰期t1/2僅有2～4 min，且極易與血漿白蛋白結(jié)合，從體內(nèi)消除，組織透過性差[10]。在水溶液及生理條件下濃度越高越容易發(fā)生自聚集，從而導(dǎo)致熒光猝滅失去光學(xué)活性[11-12]。

為克服上述問題，通常將ICG搭載在載體上，以提高其穩(wěn)定性，延長血液循環(huán)半衰期，提高其腫瘤蓄積率，進一步增加PTT的療效[13-15]。因此，本實驗選擇目前應(yīng)用比較廣泛、生物相容性較好的兩性聚電解質(zhì)O-羧甲基殼聚糖（O-CMCS）和聚陽離子載體聚乙烯亞胺（PEI）為載體，采用安全簡便的聚電解質(zhì)法制備ICG納米粒，可在一定程度上提高其在生理條件下的穩(wěn)定性，增強組織透過性和腫瘤蓄積，用于腫瘤的PTT。

1 材料

1.1 儀器

Zetasizer Nano粒度測定儀（英國Malvern公司）；JEM1200EX透射電子顯微鏡（TEM日本電子株式會社）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（上海凌科實業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司）；UV-8型紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；808 nm激光器（PSU-H-LED公司）；紅外熱像儀（Optris公司）；離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；IX71倒置熒光顯微鏡（美國Olympus公司）；SpectraMax?M3多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 試藥

吲哚菁綠（ICG，百靈威科技有限公司）；O-CMCS（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司）；PEI（廣東翁江化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，山東禹王化學(xué)試劑廠）；Sephadex G50（Pharmacia公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物制品公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美 國Sigma-Aldrich公 司）；DMSO（Biochemica Applichem公司）；4%多聚甲醛、Hoeches 33258、溶酶體綠色熒光探針、抗熒光猝滅封片液（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 細胞瘤株及動物

MCF-7細胞（上海佛雷堡生物技術(shù)有限公司）；小鼠腹水瘤細胞（S180，沈陽藥科大學(xué)藥理實驗室）。SPF級雄性KM種小鼠（體質(zhì)量20～25 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 載吲哚菁綠納米粒的制備方法

取適量ICG甲醇溶液滴加至15 mg·mL－1PEI溶液中，室溫避光攪拌10 min。室溫條件下，1000 r·min－1攪拌，將10 mg·mL－1O-CMCS以1滴·s－1的速度緩慢地滴加至PEI反應(yīng)液中，室溫避光繼續(xù)攪拌30 min，即得載藥納米粒。過0.22 μm濾膜，收集濾液于茶色西林瓶中，封口膜封好，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 載吲哚菁綠納米粒的粒徑與電位、包封率與載藥量及形態(tài)

采用Zetasizer Nano粒度測定儀于25℃散射角為90°的條件下測定載吲哚菁綠納米粒的粒徑、粒徑分布及zeta電位，測得納米粒粒徑為（148.7±5.6）nm，PDI為（0.072±0.028），粒徑分布圖如圖1所示，粒徑分布窄，zeta電位為－（21.7±0.35）mV。采用JEM1200EX透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)學(xué)，結(jié)果如圖2所示。采用葡聚糖凝膠微柱離心法測定納米粒的包封率和載藥量分別為（72.6±3.1）%、（1.5±0.8）%。

圖1 ICG NPs粒徑分布圖Fig 1 Size distribution of ICG NPs

圖2 ICG NPs透射電鏡結(jié)果Fig 2 Transmission electron microscope of ICG NPs

2.3 光熱效能

光熱轉(zhuǎn)化效率是評價光熱劑性能的重要指標(biāo)，良好的光熱劑在激光照射下，應(yīng)在一定時間內(nèi)迅速升至腫瘤組織敏感的溫度并保持一定時間，從而有效地殺死腫瘤細胞[16]。考察不同功率（1、2 W·cm－2）808 nm激光照射下不同質(zhì)量濃度ICG（5、10、20、30、40 μg·mL－1）和ICG NPs（5、10、20、30、40 μg·mL－1）對光熱轉(zhuǎn)化效率的影響，記錄時間-溫度變化曲線，結(jié)果見圖3，其Tmax光熱圖像見圖4。

由圖3和圖4可知，pH 7.4的PBS在不同功率的激光照射10 min內(nèi)，溫度基本沒有變化，這表明激光照射不能引起PBS的升溫，可排除干擾；不同濃度的游離ICG與ICG NPs在不同功率激光照射下溫度均先升高至Tmax后下降，5 min內(nèi)可升高至Tmax，且藥物濃度越高Tmax越高，因此在后續(xù)實驗中照射時間選擇為5 min；功率2 W·cm－2照射下的Tmax比1 W·cm－2相同濃度的ICG均有明顯升高，因此在后續(xù)實驗中選擇2 W·cm－2照射；在相同功率的激光照射下，相同的藥物濃度下，ICG NPs的升溫要高于游離的ICG，濃度在5～40 μg·mL－1，?T隨濃度的增加先增加后下降，這可能是因為ICG濃度過大，納米粒對ICG的分散減小，ICG因為分子聚集發(fā)生熒光猝滅，影響光熱效能；2 W·cm－2照射下ICG NPs升溫到Tmax所用時間明顯短于游離的ICG，這表明納米粒的包載提高了ICG的光學(xué)穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)化效率。

圖4 不同濃度ICG和ICG NPs在不同功率808 nm激光照射下的Tmax光熱圖像Fig 4 Tmax of ICG and ICG NPs at different concentrations under different power 808 nm laser irradiations

2.4 MTT法測定細胞毒性

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，消化稀釋成濃度為1×104個·mL－1的單細胞混懸液，取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱（5% CO2，37℃）中培養(yǎng)24 h。待細胞完全貼壁后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200 μL不同質(zhì)量濃度（1、5、10、20 μg·mL－1）的游離ICG、blank-NPs、ICG-NPs（0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌）的培養(yǎng)液溶液。同時設(shè)置對照組（加細胞和培養(yǎng)液而不加藥物）和空白組（只加培養(yǎng)液），每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。激光實驗組在加藥2 h后用近紅外激光（808 nm，2 W·cm－2，10 cm）照射5 min；無激光對照組不給予照射，放入培養(yǎng)箱分別繼續(xù)孵育24 h和48 h后，避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL－1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔各加入150 μL DMSO，振蕩使紫色結(jié)晶物完全溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm波長下的吸光度（OD值）。按照Eq.1公式計算細胞存活率。

由圖5可知，在無激光照射的條件下，空白納米粒組在本實驗考察的時間和濃度范圍內(nèi)，MCF-7細胞的存活率均＞85%，這說明由O-CMCS與PEI構(gòu)建的空白納米粒具有良好的生物安全性，不會影響后續(xù)載藥納米粒對MCF-7細胞的毒性評價。不同質(zhì)量濃度的游離ICG溶液與ICG納米粒（1、5、10、20 μg·mL－1）在無激光照射的條件下與空白納米粒組相比，隨著ICG質(zhì)量濃度的增大及孵育時間的增長MCF-7細胞存活率略減小，但在質(zhì)量濃度為20 μg·mL－1、孵育時間為48 h，細胞存活率仍＞75%，這說明無激光照射時游離的ICG溶液與ICG納米粒均對MCF-7細胞無抑制生長的作用，無細胞毒性，生物安全性良好。

圖5 空白NPs、ICG溶劑和ICG NPs對MCF-7細胞活力的影響Fig 5 Cell viability of NPs，ICG solvent，and ICG NPs incubation

在2 W·cm－2，808 nm激光照射5 min的條件下，各空白納米粒組在本實驗考察的時間和濃度范圍內(nèi)，MCF-7細胞的存活率均＞85%，這說明在沒有ICG存在的條件下，單純的體外激光照射不會抑制MCF-7細胞的生長。在808 nm激光照射的條件下，當(dāng)ICG從1 μg·mL－1增加到20 μg·mL－1時，MCF-7細胞孵育24 h的存活率從93.3%降到41.39%，孵育48 h的存活率從83.7%降到36.5%，這表明激光照射ICG產(chǎn)生的光熱作用可有效地殺死MCF-7細胞，隨著ICG質(zhì)量濃度的增大，細胞存活率明顯降低，細胞毒性顯著增大，但對比孵育24 h與48 h細胞存活率沒有明顯不同，這表明ICG的光熱治療具有明顯的濃度依賴性但無明顯的時間依賴性。不同濃度下ICG NPs的細胞生長抑制作用均大于游離ICG，這表明將ICG包載于O-CMCS/PEI納米粒中能夠顯著提高藥物的細胞毒性，特別是在高濃度時差別大。

2.5 激光共聚焦觀察溶酶體逃逸實驗

MCF-7細胞，以2×105個·mL－1的濃度接種于6孔板中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細胞生長密度達到80%，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入2 mL含ICG、ICG NPs溶液的培養(yǎng)液（不含F(xiàn)BS）后繼續(xù)孵育0.5、1、2和4 h 后，加入200 nL Lysotracker green 溶液（50 g·mL－1）繼續(xù)孵育1 h，吸去上清液，多聚甲醛固定細胞30 min，PBS清 洗3次，用10 μg·mL－1的Hoechst 33258室溫避光染細胞核10 min，移去染料，再用PBS清洗3次，取出細胞爬片反壓在載玻片上，用封片劑封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察ICG納米粒的溶酶體逃逸行為，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著孵育時間的延長，黃色區(qū)域逐漸較少，而單獨的紅色和綠色區(qū)域逐漸變多，這說明隨孵育時間的延長，逐漸地有紅色熒光的ICG從溶酶體中逃逸到細胞質(zhì)，這表明以O(shè)-CMCS/PEI制備的納米粒具有明顯的促進溶酶體逃逸的功能。

圖6 MCF-7細胞中ICG NPs胞內(nèi)溶酶體逃逸Fig 6 Intracellular lysosomal escape of ICG NPs in MCF-7 cells after incubation

2.6 藥效學(xué)實驗

2.6.1 溶血性實驗 分別取8支EP管，首先進行編號，1號設(shè)為陽性對照組，2號設(shè)為陰性對照組，3～8號設(shè)為實驗組，按表1于每管中加入2%紅細胞懸液、生理鹽水和納米?；鞈乙?，納米粒依次加入質(zhì)量濃度為250、150、100、50、10、5 μg·mL－1。輕搖混勻后將EP管置于37℃恒溫水浴中3 h，觀察管中液體狀態(tài)，若試管中的溶液呈澄明紅色狀且管底無細胞殘留則為全部溶血；若溶液澄明呈紅色或棕色且管底有少量紅細胞殘留則為部分溶血；若試管內(nèi)上層液體無色透明所有紅細胞都下沉則為無溶血。將EP管于3000 r·min－1離心5 min，吸取上清液，采用紫外分光光度法，于570 nm波長測定各組上清液的吸光度值。按照Eq.2計算溶血率。

表1 ICG NPs溶血實驗Tab 1 Hemolytic experiment of ICG NPs

ICG NPs的溶血性實驗結(jié)果如圖7所示，以生理鹽水組為陰性對照組，可見0～3 h內(nèi)不同濃度的實驗組管均未見溶血現(xiàn)象。

圖7 ICG NPs溶血實驗結(jié)果Fig 7 Hemolysis experiment for ICG NPs 1. 陽性對照組（positive control group）；2. 陰性對照組（negative control group）；3～8. 實驗組（experimental group）

ICG NPs的溶血率如圖8所示，3 h內(nèi)不同濃度的ICG NPs的溶血率均小于5%，這表明ICG NPs注射液具有良好的血液相容性，可用于后續(xù)的藥效學(xué)實驗。

圖8 不同濃度ICG NPs溶血率Fig 8 Hemolytic rate of ICG NPs at different concentration

2.6.2 荷瘤小鼠模型的建立 復(fù)蘇S180細胞，用適量生理鹽水稀釋使細胞混懸液達到適宜濃度后接種于KM種小鼠腹腔內(nèi)，每日觀察，至小鼠腹部明顯隆起時處死，局部消毒后，抽取腹水，活細胞計數(shù)后用生理鹽水稀釋至細胞濃度為有1×107個·mL－1的腹水稀釋液，取0.2 mL腹水稀釋液接種于小鼠右腋下的皮下組織內(nèi)。建立荷瘤小鼠動物模型。

2.6.3 分組與給藥 接種成功的荷瘤小鼠動物模型正常飼養(yǎng)7 d左右，當(dāng)小鼠右腋下發(fā)現(xiàn)肉眼可見的腫瘤后，測量腫瘤體積大小，選取腫瘤體積約為150 mm3的荷瘤小鼠20只，隨機分成4組，每組5只，進行編號。分別為生理鹽水組、生理鹽水＋激光照射組、ICG NPs組、ICG NPs＋激光照射組。分別于小鼠尾靜脈注射相應(yīng)的制劑，ICG的給藥劑量為2 mg·kg－1，第一次給藥記為第1日，分別在第1、4和7日各給藥一次。其中激光組需要在給藥2 h和4 h后用808 nm激光（10 cm，2 W·cm－2）照射腫瘤部位5 min，正常飼養(yǎng)小鼠。

2.6.4 藥效學(xué)評價指標(biāo) 給藥后每日觀察小鼠的精神和活動狀態(tài)，每2日稱量小鼠體質(zhì)量，并記錄；每2日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長直徑（L）和最短直徑（S）大小，然后按公式Eq.3計算腫瘤體積（V）：

于給藥后15 d脫頸處死小鼠，小心剝離腫瘤組織，用生理鹽水清洗干凈用濾紙擦干后稱量瘤重，并記錄。按Eq.4計算腫瘤抑制率（tumor inhibition rate，TIR）：

式中Ws為生理鹽水對照組腫瘤的平均瘤質(zhì)量，Wt為實驗組腫瘤的平均瘤質(zhì)量。

給藥期間各組荷瘤小鼠的飲食與活動無明顯變化，各組荷瘤小鼠的體質(zhì)量隨時間的變化見圖9，各組荷瘤小鼠的體質(zhì)量平穩(wěn)增長，這說明激光照射與ICG NPs無明顯的機體毒副作用，安全性良好。

圖9 S180荷瘤小鼠給藥15 d后體質(zhì)量變化（n＝5）Fig 9 Body mass changes of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days（n＝5）

給藥期間記錄各組荷瘤小鼠的腫瘤體積變化，如圖10，生理鹽水＋激光照射組、ICG NPs組與生理鹽水組之間無明顯差異，其腫瘤體積均隨時間的延長迅速增大，表明單獨的激光照射以及ICG NPs在無激光照射下對腫瘤的生長沒有抑制效果。而ICG NPs＋激光照射組的腫瘤生長緩慢，第一次給藥15 d后其平均腫瘤體積為386.64 mm3，這表明ICG NPs在808 nm激光照射下具有良好的腫瘤抑制活性。

圖10 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后腫瘤體積變化（n＝5）Fig 10 Tumor volume changes of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days（n＝5）

給藥15 d后，摘除荷瘤小鼠的腫瘤組織稱重，并按Eq.4計算各組的抑瘤率（TIR），結(jié)果見圖11、12。可知與生理鹽水組比較，生理鹽水＋激光照射組與ICG NPs組腫瘤組織的平均質(zhì)量無顯著差別，TIR分別為8.7%、4.6%，ICG NPs＋激光照射組抑瘤效果明顯（為75.4%），與荷瘤小鼠腫瘤體積變化趨勢大致相同，這表明僅激光照射或ICG NPs基本無明顯的腫瘤抑制作用，而ICG NPs＋激光照射組可有效的抑制腫瘤的生長。

圖11 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后腫瘤重量和腫瘤抑制率（n＝5）Fig 11 Tumor weight and tumor inhibition rate of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days（n＝5）

圖12 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后切除的腫瘤（n＝5）Fig 12 Excised tumors of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days（n＝5）

3 討論

本課題組選用生物可降解的在生理條件下負電荷兩性高分子材料O-CMCS和PEI為載體材料，采用聚電解質(zhì)復(fù)合法，制備了用于腫瘤的光熱治療包載近紅外光熱劑ICG納米粒ICG NPs。在808 nm激光照射下，ICG NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率，可明顯抑制腫瘤生長。

通過激光共聚焦顯微鏡考察ICG NPs在MCF-7細胞中的攝取行為，結(jié)果表明ICG NPs與MCF-7細胞孵育4 h時可出現(xiàn)溶酶體逃逸現(xiàn)象。這主要是因為PEI作為聚陽離子聚合物，大量的伯胺及仲胺基團在內(nèi)涵體或溶酶體的弱酸性環(huán)境中會捕獲大量質(zhì)子，與此同時也會引起大量的氯離子和水分子的內(nèi)流進溶酶體中，導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹，從而使溶酶體破裂，藥物滲漏，產(chǎn)生內(nèi)涵體或溶酶體逃逸的現(xiàn)象，這就是“質(zhì)子海綿”效應(yīng)。

通過體外溶血實驗考察了制劑靜脈注射安全性，結(jié)果證明該制劑無體內(nèi)溶血性，可用于靜脈注射。在808 nm激光照射下ICG NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率。在相同功率的激光照射下，相同的藥物濃度下，ICG NPs的升溫要高于游離的ICG，質(zhì)量濃度在5～40 μg·mL－1，?T隨濃度的增加先增加后下降，這可能是因為ICG濃度過大，納米粒對ICG的分散減小，ICG因為分子聚集發(fā)生熒光猝滅，影響光熱效能；2 W·cm－2照射下ICG NPs升溫到Tmax所用時間明顯短于游離ICG，可能是納米粒的包載阻礙了熱量的擴散，使得局部溫度短時間內(nèi)快速上升并保持較長時間，這表明納米粒的包載提高了ICG的光學(xué)穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)化效率。