不同NFC/NDF飼糧對青海藏羊育成母羊肌肉抗氧化功能、肌纖維類型組成及其相關基因表達的影響

周 力，高占紅，張春梅，馬博妍，李蔣偉，桂林生，侯生珍

（青海大學農牧學院，西寧 810016）

藏羊作為青藏高原及其毗連地區(qū)特有的種質資源，肉質以其鮮美、營養(yǎng)全面、礦物質含量豐富以及膻味少等優(yōu)點而深受消費者的青睞[1-2]。然而由于青海畜牧業(yè)受當地草地面積和生態(tài)環(huán)境的限制，藏羊的飼養(yǎng)方式由傳統的放牧飼養(yǎng)逐步變?yōu)樯犸?，而舍飼造成羊肉品質劣化已經引起了很多研究者的關注與重視。

不同肌纖維類型的比例是調控肌肉品質的關鍵因素[3]。肌纖維作為骨骼肌的基本組成單位，其數量主要是由先天遺傳決定的，但肌纖維類型之間卻可相互轉化[4]。營養(yǎng)水平是連接肌纖維類型改變與肉品質的重要橋梁，部分學者已經對此進行報道[5]。以豬為研究對象[6]，發(fā)現品種和營養(yǎng)水平會對背最長肌糖原含量和肌纖維類型產生明顯的影響。其他試驗也證實[7]，適宜的蛋白水平飼糧，不僅可以使肌肉纖維的直徑增大，同時還能增加肌間脂肪和肌肉間質含量，進而提高肌肉的產量和風味。目前，通過調整營養(yǎng)攝入量來改善畜禽肉質已經成為研究的熱點，然而主要集中于雞、鴨和鵝等家禽，對反芻動物的研究相對較少，關于飼糧組成與藏羊肌纖維形態(tài)特征更是鮮有報道。

鑒于此，本試驗旨在以不同NFC/NDF飼糧條件下育成期藏羊背最長肌作為試驗材料，利用ATP酶染色法、MyHCs基因的mRNA表達量對肌纖維進行分型以及ELISA法測定肌肉抗氧化能力，分析肌纖維類型組成的差異與抗氧化能力的大小。通過改變飼糧營養(yǎng)需要量來調控肌纖維類型的分布，從而改善肌肉品質，同時對于加強保護和利用藏羊特色品種資源具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗動物與分組

從青海省海北州高原現代畜牧示范園區(qū)選取體況良好、體重相近（26.65±0.72）kg的4月齡藏羊15只，隨機分為3組，分別飼喂NFC/NDF水平為0.92（L組）、1.39（M組）和2.20（H組）的飼糧。試驗分為預試期15 d和正試期90 d。

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗飼糧

試驗開始前，動物嚴格按照養(yǎng)殖場管理規(guī)定進行驅蟲、免疫等常規(guī)操作。試驗期間每日07:30和18:00各飼喂1次，自由采食和自由飲水，飼料全部為精飼料和燕麥干草粉攪拌混合料?；A飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1，飼糧設計參照參考《肉羊飼養(yǎng)標準》（NY/T 816-2004）[8]進行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DMS)

1.3 試驗方法

1.3.1 肌纖維組織學特性分析

在飼養(yǎng)試驗結束時，分別從每組隨機選取接近平均體重的3只試驗羊按照頸靜脈放血處死，立即取左側胴體正數第12～13肋骨間背最長肌組織2份，其中1份用于迅速放入液氮中用于抗氧化指標以及MyHCs基因表達量的測定，另外1份置于4%多聚甲醛溶液（廣州賽國生物科技有限公司）固定24 h，利用ATP酶組織化學對藏羊背最長肌進行染色[9]，利用Olympus BX51顯微鏡以及Imaginge pro plus 6.0在20×10倍下觀察并分析肌纖維特性，每個樣本取3張非連續(xù)切片，每張切片選4個完整的視野，使研究的肌纖維數目不少于1 500根[10]。測出肌纖維橫截面上最長兩點間距離，作為長軸，再過長軸中點量出垂直于長軸的長度作為短軸，求出兩者的幾何平均值作為肌纖維直徑[11]。同時直接測量記錄肌纖維的橫截面面積，作為肌纖維橫截面積，測多根求其平均值[12]。

測出每個視野的面積，計算出每個視野肌纖維的根數，換算成每平方毫米的根數，作為被測樣本的肌纖維密度[13]。統計每種類型肌纖維的數量，用每種類型肌纖維數量除以總肌纖維數量記為該種肌纖維的數量比例[14]。再用每種類型肌纖維總面積除以總肌纖維面積記為該種肌纖維的面積比例[15]。

1.3.2 肌肉抗氧化指標測定

測定羔羊肌肉中抗氧化指標，分別為過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及總抗氧化能力（total antioxygentic capacity，TAOC）含量。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，操作步驟見試劑盒說明書。

1.3.3 肌肉MyHCs基因表達量測定

使用北京天根生化科技有限公司動物組織總RNA提取試劑盒提取藏羊背最長肌中總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經微孔板分光光度計測定其吸光度（OD）值，樣品OD 260/280在1.8～2.2之間用于后續(xù)試驗。cDNA合成按Fast KingRTKit cDNA反轉錄試劑盒說明操作，反轉錄后的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。采用羅氏Light Cyler 480Ⅱ實時熒光定量PCR儀測定MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱb和MyHC Ⅱx基因相對表達量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參基因，目的基因的mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。內參及引物設計均由上海生工合成，序列見表2。

表2 引物序列及參數Table 2 Sequences and parameters of primers

1.4 數據處統計分析

所有試驗數據經Excel 2020軟件初步處理后，采用SPSS 25.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan氏法進行多重比較，結果以“平均值±標準誤（mean±SE）”表示，P20.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊肌纖維組織形態(tài)學特性的影響

由表3可知，M組Ⅰ型肌纖維直徑低于H組（P20.05）和L組（P30.05）。M組Ⅰ型肌纖維橫截面積低于L組（P20.05）與H組（P30.05）。M組?、騛型、Ⅱb型纖維橫截面積與其他2組差異不顯著（P30.05）。M組Ⅰ型肌纖維密度高于H組（P20.05）和L組（P3 0.05）。M組Ⅱa型肌纖維密度顯著高于L組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。

表3 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊肌纖維發(fā)育特點的影響Table 3 Effects of different NFC/NDF diets on muscle fiber development characteristics of Tibetan ewes

由表4可知，M組Ⅰ型肌纖維數量比例顯著高于L組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。L組Ⅱa型肌纖維數量比例顯著高于H組（P20.05），較M組差異不顯著（P30.05）。M組Ⅱb型肌纖維數量比例顯著低于L組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。

表4 不同NFC/NDF飼糧對藏羊肌纖維數量比例的影響Table 4 Effects of different NFC/NDF diets on the proportion of muscle fiber quantity of Tibetan sheep %

由表5可知，L組Ⅰ型肌纖維面積顯著低于其他2組（P30.05）。M組Ⅱa型肌纖維面積比例顯著高于其他2組（P20.05）。M組Ⅱb型肌纖維面積比例顯著低于L組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。

表5 不同NFC/NDF飼糧對藏羊肌纖維面積比例的影響Table 5 Effects of different NFC/NDF diets on proportion of muscle fiber area in Tibetan sheep %

2.2 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊MyHCs基因表達量的影響

由圖1可知，M組MyHC Ⅰ基因的mRNA相對表達量顯著高于L組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。L組MyHC Ⅱa基因的mRNA相對表達量顯著高于H組（P20.05）；較M組差異不顯著（P30.05）。L組MyHC Ⅱb基因和MyHC Ⅱx基因的mRNA相對表達量顯著高于M組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。

圖1 藏羊肌纖維類型相關基因的mRNA相對表達量Figure 1 Relative mRNA expression levels of muscle fiber type related genes of Tibetan sheep

2.3 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊肌肉抗氧化功能的影響

由表6可知，L組過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著低于M組（P20.05），較H組差異不顯著（P30.05）。M組谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性高于 L組（P30.05）和 H組（P20.05）。各組間總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量差異不顯著（P30.05）。

表6 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊肌肉抗氧化能力的影響Table 6 Effects of different NFC/NDF diets on antioxidant capacity of muscle of Tibetan ewes

3 討論

3.1 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊肌纖維組織形態(tài)學特性的影響

動物出生后，肌肉中肌纖維的數量已基本確定，但一些外界因素如營養(yǎng)水平、環(huán)境溫度、運動狀態(tài)和應激等均會影響肌纖維類型之間的相互轉化[16-17]。根據肌纖維所含肌球蛋白重鏈的不同，可將其分為4種類型，即Ⅰ型（慢速氧化型肌纖維）、Ⅱa型（快速氧化型肌纖維）、Ⅱb型（快速酵解型肌纖維）和Ⅱx型（中間型肌纖維）[18]。MyHCs基因表達量的高低，又可表現為肌纖維類型的轉化。因此，研究不同骨骼肌肌纖維類型的組成及其MyHCs基因的表達水平對于改善羔羊肉質具有重要的實踐意義。Hwang Y.H.等[19]指出，增加Ⅰ型纖維的比例和降低Ⅱb型纖維的比例能夠提高肌肉嫩度，進而改善牛肉品質。G.Renand等[20]研究也發(fā)現，Ⅱb型肌纖維比例與剪切力呈正相關，但與嫩度呈負相關。白艷蘋等[21]進一步證明，日糧添加乳酸菌可以通過提高氧化型肌纖維的比例改善肌肉色澤，提高肌肉嫩度，從而提高羊肉品質。以牦牛為研究對象[22]，發(fā)現氧化型纖維比例高可改善肉質，同時肌纖維類型與其肌球蛋白重鏈基因表達豐度具有一定的聯系。以上研究均表明酵解型纖維比例過高會造成肉質降低，這與本試驗肌纖維類型研究結果具有相似之處。本試驗通過ATP酶染色法和MyHCs基因表達量對肌纖維分型，得出適宜NFC/NDF飼糧能使青海藏羊背最長肌肌纖維類型由酵解型纖維（MyHC Ⅱb和MyHC Ⅱx）向氧化型纖維（MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱa）轉化。由此說明適宜的NFC/NDF飼糧可以增加氧化型纖維的數量，從而改善羔羊肉質。

3.2 不同NFC/NDF飼糧對藏母羊背最長肌抗氧化功能的影響

正常情況下，機體內自由基的生成與其機體抗氧化防御系統之間處于一種動態(tài)平衡，一旦受到自身或外在因素影響后，體內的平衡會被打破，從而造成氧化損傷[23]。機體主要抗氧化物質包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，總抗氧化能力和丙二醛含量等。其中過氧化氫酶主要參與活性氧代謝過程[24]。丙二醛能夠間接地反映機體內氧自由基代謝的狀況[25]，谷胱甘肽過氧化物酶能夠促進過氧化氫、有機氫過氧化物和脂質氫過氧化物的還原，保護機體免受氧化損傷[26]，超氧化物歧化酶主要作用是清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷[27]，而總抗氧化能力是衡量機體抗氧化系統功能的綜合指標[28]。據報道，宰后肌肉的氧化反應能夠明顯地影響食用品質，但在動物飼糧中適當加入抗氧化物質、選擇合適的飼養(yǎng)方式以及適當的加工保存等均可影響宰后肌肉的氧化速率，繼而提高肌肉品質[29]。有試驗表明，在母羊飼糧中適宜降低精料比例有利于產后早期斷奶羔羊提高抗氧化能力[30]。本試驗中，與L組和H組相比，M組肌肉總抗氧化能力含量升高，同時超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性提高，而丙二醛含量則下降。這表明適宜的NFC/NDF飼糧能夠降低氧自由基的影響，提高機體抗氧化能力，從而達到改善肉質目的。

4 結論

綜上，在本試驗條件下，適宜的NFC/NDF飼糧可使育成期藏母羊背最長肌氧化型肌纖維類型的數量增多并有效提高抗氧化能力，其中NFC/NDF為1.39的飼糧效果較好。