吳志煥，曹曉涵，曹丹丹

（1.河北工程技術(shù)學(xué)院，石家莊 050091；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014；3.河北醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院/河北省環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050017）

高脂血癥是指脂代謝方面的多種問(wèn)題[1]，包括膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的升高等。研究降血脂藥物首先要有高脂血癥的動(dòng)物模型，目前此類模型的動(dòng)物主要有鼠類、兔、豬等動(dòng)物，鼠類是最常用的動(dòng)物模型。昆明小鼠作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的常用動(dòng)物，具有操作簡(jiǎn)便，飼養(yǎng)方便，尤其具有生長(zhǎng)發(fā)育較快，代謝旺盛等優(yōu)點(diǎn)。因此，為了更好地研究群體對(duì)脂類代謝的特點(diǎn)，本文擬用昆明小鼠，通過(guò)高脂飼料的喂養(yǎng)[2]，建立小鼠的高血脂模型；用該高脂模型小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究降血脂藥物三七丹參片對(duì)小鼠血脂水平的影響，以期為三七丹參片的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

昆明小鼠80只（雌雄各半，體重20 g左右），購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，購(gòu)買后常規(guī)飼養(yǎng)一周，期間自由飲水，監(jiān)測(cè)健康狀況。按照下述方法分組和處理。

建立高脂模型組小鼠：選取20只昆明小鼠（雌雄各半），隨機(jī)分為 2組（n=10），記為正常組和高脂組，并對(duì)各組小鼠稱重記錄。

三七丹參片降脂組小鼠：選取60只昆明小鼠（雌雄各半）。隨機(jī)分為6組（n=10），記為空白對(duì)照組，高脂模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛伐他汀組），三七丹參片低、中、高劑量組，并對(duì)各組小鼠稱重記錄。

1.2 藥品和試劑

辛伐他汀片及三七丹參片：購(gòu)于常規(guī)藥店，研缽內(nèi)研磨成粉狀備用。

血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于Beckman Coulter，Inc.公司，糖化血清蛋白（GSP）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司。其他檢測(cè)試劑均為分析純。

飼料購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。配方：基礎(chǔ)飼料為23.07%蛋白質(zhì)+11.85%脂肪+65.08%碳水化合物；高脂飼料為基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)，全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，超速冷凍高速離心機(jī)，全自動(dòng)生化分析儀，移液器等。

1.4 高脂模型小鼠建立

20只昆明小鼠，適應(yīng)性飼喂1周，隨機(jī)分為正常組和高脂組（n=10）。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂組飼喂高脂飼料，均為4～6 g/d只，自由飲水。連續(xù)飼喂30 d。每5天稱重并記錄體重。

1.5 降脂組小鼠處理

陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體灌胃0.01 g/（kg·d）辛伐他汀，低、中、高劑量組分別灌喂0.5、1.0、2.0 g/（kg·d）三七丹參片，高脂模型組和空白對(duì)照組以相同方法灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d，每天稱重1次，末次灌喂前16 h停食停水，末次灌喂1 h后即眼眶靜脈采血。后頸椎脫臼法處死小鼠，取肝組織，稱重記錄后分為兩份，1份甲醛固定，1份凍存于液氮，備用。

1.6 體重測(cè)定

動(dòng)物適應(yīng)性飼喂一周后稱取各鼠體重。試驗(yàn)期間每5日飼喂前進(jìn)行稱重。試驗(yàn)結(jié)束前一天禁食禁水 12 h 以上稱取體重。根據(jù) 0、5、10、15、20、25、30 d的體重，統(tǒng)計(jì)各組小鼠體重的增重情況，計(jì)算增重率，增重率=（終末平均體重-初始平均體重）/初始平均體重×100%。

1.7 血清處理及血脂指標(biāo)測(cè)定

各組采血后血樣室溫放置 1 h后4℃冰箱過(guò)夜，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，-20℃保存，測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定 TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU和GSP等6項(xiàng)指標(biāo)。

1.8 組織采集和HE染色

各組小鼠脫頸處死后，迅速分離肝組織，稱重，計(jì)算肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)=肝臟重/體重×100%。采集部分肝組織經(jīng)4%多聚甲醛組織固定液進(jìn)行固定。固定組織經(jīng)HE染色分析其病理。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS20.0軟件處理。數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)結(jié)果使用單因素方差分析，組間差異使用LSD法比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重

從 0、5、10、15、20、25 和 30 d 統(tǒng)計(jì)的體重?cái)?shù)據(jù)分析，從第5天開(kāi)始高脂組的體重就明顯高于正常組，增長(zhǎng)速度明顯快于正常組，30 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高脂組小鼠體重比正常組平均重約3 g，其增重率高于正常組約12%。從第5天開(kāi)始兩組體重的增重率已經(jīng)有顯著差異（P20.01）。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 昆明小鼠體重增重結(jié)果統(tǒng)計(jì)（±S，n=10）Table 1 Weight changes of Kunming mice(±S，n=10)g

2.2 肝重及肝臟組織觀察結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)束取肝組織稱重發(fā)現(xiàn)，正常組的肝重為（1.11±0.08）g，高脂組的肝重為（1.38±0.11）g，極顯著高于正常組（P20.01）。肉眼觀察肝臟組織，高脂組的肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，呈現(xiàn)出明顯的脂肪肝病變（圖1）；肝組織切片HE染色顯微觀察發(fā)現(xiàn)：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞整齊排列，未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)變化；高脂組肝臟組織的結(jié)構(gòu)明顯病變，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞內(nèi)具有大小不等的圓形空泡（脂肪滴）。中央靜脈和小葉間靜脈還出現(xiàn)了少量紅細(xì)胞（圖2）。

圖1 肝臟外觀圖Figure 1 Liver appearance

圖2 HE染色肝組織圖（1 600×1 200）Figure 2 Liver tissue stained with HE（1 600×1 200）

2.3 小鼠血脂水平的化學(xué)檢測(cè)

通過(guò)生化分析測(cè)得高脂組血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）分別為正常組的 1.7倍、1.4倍、1.5倍，差異極顯著（P20.01），但高密度脂蛋白（HDL-C）濃度高脂組與正常組無(wú)顯著差異（P30.05）（表 2）。

表2 昆明小鼠血清血脂相關(guān)指標(biāo)（±S，n=10）Table 2 Indexes of serum lipids in Kunming mice（±S，n=10）mmol·L-1

以上試驗(yàn)結(jié)果表明，高血脂小鼠模型建造成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 三七丹參片對(duì)小鼠體重的影響

對(duì)正常小鼠和高脂小鼠進(jìn)行不同種類和劑量的藥品灌胃后，稱量體重，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，每組小鼠均有一定的體重增長(zhǎng)，正常組、高脂組、陽(yáng)性組以及三七丹參片高、中、低劑量組增重分別為 6.11、9.45、6.38、7.08、7.6 和 8.64 g。其中增重最低的是正常組，增重最多的是高脂組，符合試驗(yàn)預(yù)期。而服用了三七丹參片后，各組小鼠體重增加有所減少，其中高劑量組增重的減少最明顯，最靠近陽(yáng)性對(duì)照（即辛伐他汀片）。說(shuō)明三七丹參片有良好的控制體重的效果。

2.5 三七丹參片對(duì)小鼠肝臟重的影響

對(duì)正常小鼠和高脂小鼠進(jìn)行不同種類和劑量的藥品灌胃后，處死后稱量肝臟重和體重，計(jì)算肝臟系數(shù)，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，肝臟系數(shù)均有所降低，雖然差異不顯著（P30.05），但其中高劑量組有明顯的降低趨勢(shì)。說(shuō)明三七丹參片有良好的控制肝重的效果。

圖4 三七丹參片對(duì)小鼠肝臟系數(shù)的影響Figure 4 Effect of Sanqi Danshen Tablet on liver coefficient of Kunming mice

2.6 三七丹參片對(duì)小鼠血液指標(biāo)的影響

2.6.1 三七丹參片對(duì)小鼠血脂的影響

對(duì)正常小鼠和高脂小鼠進(jìn)行不同種類和劑量的藥品灌胃后，斷頸處死立即采血，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中血脂相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果如圖5a～圖5d所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，高劑量組的血脂指標(biāo)有所降低，說(shuō)明三七丹參片起到了良好的降血脂的效果。

圖5 三七丹參片對(duì)小鼠血清血脂的影響Figure 5 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum lipid in mice

2.6.2 三七丹參片對(duì)小鼠血糖的影響

對(duì)正常小鼠和高脂小鼠進(jìn)行不同種類和劑量的藥品灌胃后，斷頸處死立即采血，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中血糖和糖化血清蛋白2項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果如圖6所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，高劑量組的2項(xiàng)血糖相關(guān)指標(biāo)有降低，說(shuō)明三七丹參片起到了良好的降血糖的效果。

圖6 三七丹參片對(duì)小鼠血清血糖的影響Figure 6 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum glucose in mice

3 討論

建立良好的高血脂模型對(duì)高脂血癥以及降血脂藥物的研究具有重要的意義。目前，常用的有基因缺陷型模型動(dòng)物、注射或者高脂飼料飼喂等方法，以大鼠、小鼠和兔等動(dòng)物為研究對(duì)象來(lái)建立高脂模型。基因缺陷型方法造價(jià)較高，注射方法動(dòng)物較難長(zhǎng)時(shí)間耐受，所以本研究選擇操作簡(jiǎn)單的高脂飼料飼喂方法，并選取代謝水平較高、生長(zhǎng)發(fā)育較快、易操作的昆明小鼠作為研究對(duì)象。

研究結(jié)果分析表明20只昆明小鼠均能很好地耐受高脂飲食，試驗(yàn)過(guò)程并沒(méi)有拒食現(xiàn)象的出現(xiàn)。從飼喂第5天開(kāi)始，高脂組與正常組體重就出現(xiàn)明顯差異，其體重增長(zhǎng)速度明顯快于正常組，說(shuō)明小鼠對(duì)高脂飼料的代謝與吸收具有良好的效果。30 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高脂組小鼠體重比正常組重約4 g，其增重率高于正常組約12%，這也符合高脂血癥體重增加的特點(diǎn)，且經(jīng)分析均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P20.01）。試驗(yàn)結(jié)束稱得肝重，結(jié)果顯示高脂組的肝重明顯高于正常組（P20.01），且肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，高脂組的肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，預(yù)示脂肪肝病變的出現(xiàn)，同時(shí)表明已初步成功建立了小鼠高脂模型。肝組織切片HE染色顯微觀察顯示高脂組肝臟組織的肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞內(nèi)具有大小不等的脂肪滴出現(xiàn)，中央靜脈和小葉間靜脈還出現(xiàn)了少量紅細(xì)胞，充分表明高脂組肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯病變，進(jìn)一步驗(yàn)證高脂飼料喂養(yǎng)成功建立了高脂模型[3-4]。小鼠血清血脂的檢測(cè)結(jié)果表明高脂組血清TC、TG和LDL-C等血脂指標(biāo)均明顯高于正常組（P20.01），說(shuō)明本研究形成了預(yù)期的高血脂模型。

綜上研究結(jié)果表明，通過(guò)給昆明小鼠飼喂30 d高脂飼料，成功建立了小鼠高脂模型，該模型與人類高脂血癥癥狀極為相似，可為后續(xù)高脂血癥臨床藥理的研究提供很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚5]。

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官。研究證明，隨著高脂飲食的喂養(yǎng)，小鼠的體重及肝重均會(huì)呈現(xiàn)高于正常組的趨勢(shì)。觀察三七丹參片干預(yù)是否可以改善高脂飲食帶來(lái)的體重及肝重的增加。另外，以辛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行效果比對(duì)[6]。給藥結(jié)束后，考察各組小鼠血脂（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）和血糖（糖化血清蛋白、葡萄糖）等指標(biāo)[7-9]，觀察三七丹參片干預(yù)對(duì)高脂小鼠血脂、血糖[9-10]的影響。本研究結(jié)果顯示，三七丹參片對(duì)高脂食物造成的高血脂小鼠有很好的降血脂和降血糖作用。近年來(lái)，中草藥綜合調(diào)節(jié)血脂、血糖的優(yōu)勢(shì)，已成為降脂藥物研究的主要方向[5]。三七丹參片除了增強(qiáng)免疫功能等療效外[11]，本研究結(jié)果也為它在治療高脂血癥的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。