紫色象草輻射誘變M2代的遺傳和表型變異研究

朱 杰，武炳超，張 歡，洪文鍇，鄒 坤，李遠(yuǎn)麗，李佳璇，黃琳凱

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，成都 611130）

狼尾草屬（Pennisetum Rich）是禾本科（Poaceae）黍亞科（Panicoideae A.Br.）的一年生或多年生草本植物，在全世界種類居多，約140種，大多數(shù)原產(chǎn)于非洲[1]，具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、利用價(jià)值高及耐瘠、耐肥、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。其育種，包括品種資源的生產(chǎn)表現(xiàn)及優(yōu)良新種質(zhì)的創(chuàng)新受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍重視[3]，除了作為優(yōu)良牧草外還可用作能源植物。在我國(guó)利用人工栽培的品種主要有多年生的象草（Pennisetum purpureum）、一年生的美洲狼尾草（Pennisetum americanum），及通過(guò)二者雜交產(chǎn)生的雜交種種雜交狼尾草（Pennisetum americanum×Pennisetum purpureum）等[4]。

象草，別名紫狼尾草，是禾本科狼尾草屬多年生大型草本植物[5]。在20世紀(jì)40年代初，由我國(guó)的四川、廣東從印度、緬甸先引入試種，之后傳入湖南、江蘇等地[6]，是一種適合在我國(guó)南方熱帶亞熱帶地區(qū)種植的優(yōu)質(zhì)飼草[7]。象草作為應(yīng)用最為廣泛的狼尾草屬牧草之一，具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、分蘗多、再生性強(qiáng)和適口性好等特點(diǎn)[8]，同時(shí)它的植物組織結(jié)構(gòu)具有粗糙、堅(jiān)硬、多莖和多孔的物理特性[9]，通常調(diào)制成干草或作為青刈飼料、青貯飼料喂養(yǎng)家畜[10]。20世紀(jì)90年代，美國(guó)研究中發(fā)現(xiàn)，象草能作為能源植物，進(jìn)行乙醇、沼氣和電能的生產(chǎn)[11-14]，可代替煤炭和石油等傳統(tǒng)能源燃料，不會(huì)增加二氧化碳排放量，并能在一定程度上防止全球變暖。還有人將象草作為一種保護(hù)生態(tài)和美化環(huán)境的植物，其具有強(qiáng)大的根系，能深入土層，耐旱力較強(qiáng)，是凈化空氣、保持水土，調(diào)節(jié)氣候的理想草種[15-16]。

SSR（simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）分子標(biāo)記是一類廣泛分布于真核生物基因組中的小型重復(fù)片段，又叫微衛(wèi)星分子標(biāo)記，按照來(lái)源可以分為 gSSR（genomic SSR）和 EST-SSR（expressed sequence tag SSR）[17]。二者之間，gSSR分子標(biāo)記具有更好的多態(tài)性[18]，因此其在遺傳多樣性和遺傳完整性的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。本團(tuán)隊(duì)前期利用60Co-γ射線對(duì)象草種莖進(jìn)行照射處理后出現(xiàn)了矮化的突變體植株，將矮化植株莖稈分割為包含兩個(gè)莖節(jié)的小段再次種植，多年篩選后得到了保持矮化的突變體2代（M2）植株。然后對(duì)M2代矮化突變體的表型性狀變異進(jìn)行鑒定研究，并利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)M2代突變體發(fā)生矮化的分子機(jī)制進(jìn)行分析。初步探究了輻射誘變誘導(dǎo)象草矮化的遺傳效應(yīng)，并獲得了兩株明顯矮化的象草突變體，為將來(lái)的象草育種項(xiàng)目提供原始材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料共有24份，包括1份未經(jīng)輻射的對(duì)照材料和23份M2代矮化突變體材料，種植條件相同，均栽培于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都崇州實(shí)驗(yàn)基地。利用60Co-γ射線照射象草發(fā)現(xiàn)了有明顯的矮化突變體為M0代植株，隨后將矮化植株莖稈分為包含兩個(gè)莖節(jié)的小段再次種植，長(zhǎng)大后仍保持矮化的植株為M1代，然后再進(jìn)行一次選擇后出現(xiàn)的矮化突變體為M2代。取幼嫩的葉片，清洗干凈后利用凍存管保存在液氮中用于后續(xù)試驗(yàn)。材料均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草種質(zhì)基因庫(kù)，為了保證材料的遺傳背景相同，所有的試驗(yàn)材料均利用無(wú)性繁殖的方式獲得。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)植株進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)，在植株生長(zhǎng)發(fā)育成熟后，就表型性狀進(jìn)行細(xì)致的觀察記錄。利用游標(biāo)卡尺和米尺等工具，對(duì)24份供試材料進(jìn)行包括分蘗數(shù)、株高（每株最高點(diǎn)的自然高度）、莖節(jié)數(shù)（最高分蘗的莖節(jié)數(shù)）、節(jié)間長(zhǎng)（最高分蘗的節(jié)間長(zhǎng)）、葉寬（葉片的最寬處）及莖粗共6個(gè)表型形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定。除了莖間長(zhǎng)、莖節(jié)數(shù)及分蘗數(shù)有固定的數(shù)據(jù)外，莖粗重復(fù)測(cè)定10次，其余剩下的指標(biāo)進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記

①DNA提?。涸跍y(cè)定形態(tài)指標(biāo)的24個(gè)單株中，取約1 g適量新鮮幼嫩的葉片，使用DNA快速提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）提取DNA[19-20]，對(duì)于DNA的質(zhì)量，并分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，將檢測(cè)結(jié)果合格的樣品保存于-20℃。在進(jìn)行后續(xù)操作時(shí)，直接用TE將樣品原液濃度稀釋至20 ng/μL，并于4℃環(huán)境保存。

②SSR標(biāo)記引物及反應(yīng)體系：利用1個(gè)對(duì)照材料和隨機(jī)挑選5個(gè)突變體作為引物的篩選，試驗(yàn)引物由本課題組前期對(duì)象草Survey測(cè)序獲得的基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)[21]，從中選出gSSR和EST-SSR各20對(duì)引物用于篩選，并將擴(kuò)增后條帶清晰且多態(tài)性好的10對(duì)引物用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系和程序及產(chǎn)物檢測(cè)參照武炳超等[22]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)24個(gè)單株的形態(tài)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，選擇單因素方差分析（one-way ANOVA），對(duì)顯著性水平進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)。對(duì)獲得的清晰可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，建立原始矩陣，在相同遷移位置上，對(duì)穩(wěn)定且清晰的條帶的有無(wú)賦值為“1”和“0”，并計(jì)算出多態(tài)性條帶所占的比率（percentage of poly-morphic bands，PPB，Eq.1）。通過(guò)對(duì) Popgene version 1.32[23]的使用，計(jì)算出供試材料的有效等位基因數(shù)（Ne，Eq.2）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H，Eq.3）[24]以及 Shannon 信息指數(shù)（I，Eq.4）[25]，使用 NTSYSpc 2.1（Ver-sion 2.10s）統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算對(duì)照材料與突變體材料之間的遺傳相似系數(shù)（genetic similarity coefficient，GSC），并用Past 3繪制出供試材料之間的UPGMA聚類圖，旨在探究矮化突變體材料與對(duì)照材料之間的親緣關(guān)系。遺傳多樣性參數(shù)方程如下：

N為多態(tài)性條帶的數(shù)量，M為條帶總數(shù)，k為等位基因數(shù)，Pi為第i個(gè)等位基因的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 未經(jīng)輻射的象草與誘變后M2代材料的表型差異

對(duì)24株象草材料分別進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量統(tǒng)計(jì)，突變體命名規(guī)則見(jiàn)表1。與對(duì)照相比，23株突變體植株中，除M2-11外其它植株均至少有一項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)存在顯著或極顯著差異（表1）。其中，有16株的株高、17株的葉寬以及10株的莖粗存在著顯著或極顯著差異，它們分別占總數(shù)的69.60%、73.90%和43.50%。并且，多數(shù)突變體植株的株高、莖節(jié)數(shù)和分蘗數(shù)，都出現(xiàn)了不同程度差異上的降低或減少，可能會(huì)降低相應(yīng)突變體的生物量，產(chǎn)生了比較明顯的變異。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)突變材料M2-8和M2-17的株高、葉寬和莖粗共3項(xiàng)指標(biāo)，都與對(duì)照材料存在顯著或極顯著差異，分蘗數(shù)、節(jié)間長(zhǎng)和莖節(jié)數(shù)都少于或低于對(duì)照材料，出現(xiàn)了明顯的矮化。

表1 24份材料不同形態(tài)指標(biāo)變異Table 1 Variation of morphological indexes of 24 materials

2.2 SSR標(biāo)記差異

2.2.1 遺傳多樣性分析

對(duì)篩選出的10對(duì)引物進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段的大小為50～500 bp（圖1），共擴(kuò)增出了209條明顯清晰可見(jiàn)的條帶，其中多態(tài)性條帶有201條，平均每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶為20.90條，引物的多態(tài)性條帶的比率為96.17%，可見(jiàn)其多態(tài)性很高。多態(tài)信息含量（PIC）中引物EST3的PIC最大，引物 SSR14的 PIC最?。ū?2），在 0.04～0.38之間，平均為0.25。對(duì)24份材料的基因多樣性、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性信息含量（PIC）進(jìn)行分析（表3），發(fā)現(xiàn)Shannon信息指數(shù)最大值為0.69，最小值為0.00，24份材料中遺傳變異程度的差異很大，也說(shuō)明經(jīng)過(guò)輻射誘變后的象草突變體后代有豐富的遺傳多樣性。

表2 10對(duì)引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Table 2 10 pairs of primer sequences and their amplification results

表3 24份材料基于SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析Table 3 Polymorphism analysis of 24 materials based on SSR markers

圖1 引物SSR15擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 The electrophoresis of SSR15 amplification product

2.2.2 遺傳相似性分析

將SSR引物擴(kuò)增出的條帶作為依據(jù)，計(jì)算出突變材料與對(duì)照材料之間的遺傳相似系數(shù)。由表4可知，遺傳相似系數(shù)在0.61～0.78之間，算出平均值為0.71，遺傳相似系數(shù)不是很大。和對(duì)照相比，在所有的突變體材料中，與突變材料M2-1的遺傳相似系數(shù)最小，為0.61，說(shuō)明該材料與對(duì)照材料的遺傳差異最大，親緣性最不明顯；而與突變材料M2-14的遺傳相似系數(shù)最大，為0.78，說(shuō)明其與對(duì)照材料的遺傳差異最小，親緣性最為接近。

表4 輻射M2代與對(duì)照材料間的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficient between radiation M2 generation and control material

2.2.3 UPGMA聚類分析

為進(jìn)一步探究輻射M2代材料與對(duì)照材料之間的親緣關(guān)系，通過(guò)非加權(quán)平均法（UPGMA），利用分析所得的條帶原始矩陣對(duì)親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(shù)（圖2）進(jìn)行構(gòu)建。由圖可見(jiàn)，突變材料M2-8和M2-17聚為一類，且它們與對(duì)照材料的遺傳距離相差較遠(yuǎn)，說(shuō)明這兩株突變體材料發(fā)生變異的程度較大。圖中顯示，M2-1與對(duì)照材料之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，表明M2-1發(fā)生變異的程度是最大的。而M2-14和M2-15與M2-18和M2-19兩個(gè)材料之間差異特別小，與對(duì)照材料的遺傳距離也較近，說(shuō)明它們變異的程度較小，發(fā)生變異的可能性較低。但對(duì)于其他突變體材料，都在不同距離不同程度與對(duì)照材料分開(kāi)，表明它們都發(fā)生了不同程度的變異。

圖2 M2代突變體材料的UPGMA聚類圖Figure 2 UPGMA cluster diagram of M2 generation mutants

3 討論

對(duì)于草食動(dòng)物而言，象草可以為其提供大量?jī)?yōu)質(zhì)牧草[26]。在植物景觀方面，象草本身還具有一定的觀賞效果[27]。矮稈小麥和水稻的應(yīng)用是“第一次綠色革命”成功的關(guān)鍵因素之一，在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，矮化性狀與作物產(chǎn)量增加、高結(jié)實(shí)率、早熟和高分蘗能力之間存在密切關(guān)系。如畢波[28]利用100 Gy60Co-γ射線對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織進(jìn)行照射，篩選其田間表型后進(jìn)行了一年半的表型觀察研究，發(fā)現(xiàn)了一株矮化突變體植株，經(jīng)半年的修剪移栽，矮化突變體植株依然保持良好的性狀，其葉片變短變寬、莖間直徑變粗，草叢高度明顯變矮，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。武炳超等[29]利用10、20和30 Gy劑量的60Co-γ射線照射象草種莖，研究其表型性狀變異時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)顯著矮小化的突變體F30-39和F30-41。劉天增等[30]將海濱雀稗4個(gè)品種Sea Isle 2000、Platinum、Supreme、Salam作為材料，利用60Co-γ射線以0.12 Gy/min 的強(qiáng)度在 0、40、45、50 和 55 Gy 5 個(gè)劑量下分別照射種莖，從輻射群體中共選育出葉寬、葉長(zhǎng)、株高、匍匐莖節(jié)間長(zhǎng)度和直徑以及密度等9個(gè)指標(biāo)均不同程度地優(yōu)于各自對(duì)照的突變體材料，為新品種選育提供了優(yōu)異的育種新材料。本試驗(yàn)前期利用60Co-γ射線對(duì)象草種莖進(jìn)行照射處理后出現(xiàn)了矮化的突變體植株，將矮化植株莖稈分為包含兩個(gè)莖節(jié)的小段再次種植，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)大后紫色象草仍保持矮化，研究其表型性狀與對(duì)照相比，23株突變體植株中除M2-11外均至少有一個(gè)或多個(gè)形態(tài)指標(biāo)顯著或極顯著減小，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。其中株高、分蘗數(shù)以及莖節(jié)數(shù)最為敏感，容易發(fā)生突變。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)突變體的株高、莖節(jié)數(shù)和分蘗數(shù)呈不同程度的降低或減少，可能造成大部分突變體生物量降低，發(fā)生矮化突變。矮化材料可以作為育種材料，與生物量比較高的材料進(jìn)行雜交，得到抗逆性和生物量兼具的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)。對(duì)矮化突變體的發(fā)現(xiàn)，不僅可以豐富育種資源，甚至能夠推動(dòng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，例如“綠色革命”的推動(dòng)就是由于矮化品種應(yīng)用到了育種之中。并且，矮化植株對(duì)于密集種植很適合，栽培和管理起來(lái)較容易，因而它在生產(chǎn)應(yīng)用上相比于其他植株具有較大優(yōu)勢(shì)[31]。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)M2-8和M2-17的株高、葉寬和莖粗3項(xiàng)指標(biāo)都與對(duì)照材料存在顯著或極顯著差異[32]，分蘗數(shù)、節(jié)間長(zhǎng)和莖節(jié)數(shù)都少于或低于對(duì)照材料，出現(xiàn)了明顯的矮化。

SSR標(biāo)記是一種共顯性分子標(biāo)記，具有含量豐富、信息量高和多態(tài)性好的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最好的研究群體遺傳變異的分子標(biāo)記之一。例如楊延兵等[33]利用SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)源于不同生態(tài)區(qū)的12個(gè)骨干谷子品種進(jìn)行遺傳差異分析，發(fā)現(xiàn)12份材料的遺傳距離變幅為0.14～0.80，平均為0.47。苗華榮等[34]利用SSR標(biāo)記，以60Co-γ射線輻照花生品種魯花11號(hào)，通過(guò)調(diào)查其M2代植株農(nóng)藝性狀，篩選得到了7個(gè)葉部特征明顯變異的突變材料，并且發(fā)現(xiàn)突變材料與原品種之間，存在著不同程度的多態(tài)性，且都呈現(xiàn)出多個(gè)位點(diǎn)突變。于立偉等[35]利用SSR分子標(biāo)記，對(duì)2個(gè)玉米（Zea mays）突變體和野生型進(jìn)行遺傳變異分析，證明遺傳差異存在的真實(shí)性，本試驗(yàn)研究與其結(jié)果大體一致?？傮w來(lái)講，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果僅僅對(duì)象草輻射M2代與對(duì)照材料之間，在分子水平上的遺傳差異進(jìn)行了鑒定，探究出了矮化突變體的突變?cè)?，很大可能性是由遺傳因素所引起的變異，對(duì)于可能發(fā)生突變的基因的鑒定還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

輻射后經(jīng)兩代篩選得到的矮化突變體象草都發(fā)生了不同程度的變異，其中株高、分蘗數(shù)和莖節(jié)數(shù)最為敏感，容易發(fā)生突變。結(jié)合所有供試材料表型及遺傳變異的結(jié)果，推測(cè)矮化突變體的突變?cè)蚝艽罂赡苄允怯蛇z傳因素所引起的變異。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)顯著矮小化的突變體材料M2-8和M2-17，可為后續(xù)象草遺傳育種項(xiàng)目提供原始材料。