晏明瑤，王 浩，黃小麗，魏 震，楊世勇，劉紹春，姜 俊*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川省水產(chǎn)局，成都 610041；3.湖南漁美康生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，長沙 410300）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，具有生長快、適應(yīng)力強(qiáng)、養(yǎng)殖成本低，肉味鮮美等優(yōu)點(diǎn)，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類。近10年，其全國養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量持續(xù)快速增長，由2007年的26.55萬t增長到2019年的208.96萬t，增長了6.87倍，年均增長率57.25%[1]，已成為我國第六大淡水養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量僅次于鯽魚的275.56萬t[2]。然而隨著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展，競爭加劇，現(xiàn)有“養(yǎng)繁一體”的主養(yǎng)模式存在養(yǎng)殖產(chǎn)量不穩(wěn)、商品蝦規(guī)格小和種質(zhì)退化嚴(yán)重等問題日益突出，急需變革為“養(yǎng)繁分離，精準(zhǔn)養(yǎng)殖”的新模式[1]。而優(yōu)質(zhì)蝦苗足量穩(wěn)定供應(yīng)是“養(yǎng)繁分離，精準(zhǔn)養(yǎng)殖”新模式的前提，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)大蝦、早上市，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。但目前我國大部分地區(qū)克氏原鰲蝦秋季苗種繁育存在日照不足、水溫偏低、水體清瘦和天然餌料供給不足，難以滿足培育大量苗種的需要，蝦苗攝食不足、生長慢和饑餓死亡，導(dǎo)致規(guī)格小、成活率低等問題，嚴(yán)重制約了新養(yǎng)殖模式的實(shí)現(xiàn)度。因此，克氏原螯蝦苗種培育人工飼料研發(fā)已成為當(dāng)前克氏原鰲蝦產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型過程中亟待攻克的關(guān)鍵問題。

生物發(fā)酵飼料是以配合飼料為原材料，經(jīng)人工控制溫度、水分等條件下，通過某種微生物代謝作用，轉(zhuǎn)化為富含益生菌及其分解產(chǎn)物的飼料[3]。與傳統(tǒng)飼料相比，發(fā)酵飼料可以轉(zhuǎn)化飼料中大分子營養(yǎng)物質(zhì)、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，從而提高飼料適口性和可消化性，促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長[3]。有研究報道，發(fā)酵豆粕和玉米粕等原料可提高生長初期克氏原螯蝦（6.75～21.0 g）的消化能力，促進(jìn)生長[4]；飼料經(jīng)植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵后，可以顯著提高生長期克氏原螯蝦（4.61～33.90 g）肝胰腺抗氧化能力和生長性能[5]；發(fā)酵濃縮料可提高生長期克氏原螯蝦（5.24～11.64 g）消化酶活力和生長性能[6]。相對而言，發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦上的應(yīng)用研究較少，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

因此，本文選擇市售的顆粒飼料與發(fā)酵飼料進(jìn)行養(yǎng)殖效果對比試驗(yàn)，并對其生長性能、腸道結(jié)構(gòu)和消化能力等指標(biāo)進(jìn)行測定，以期為發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦幼蝦培育上的應(yīng)用和推廣提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)蝦選擇平均體重為0.28 g的克氏原螯蝦幼蝦，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)克氏原螯蝦研究基地飼養(yǎng)孵化，水溫保持25℃。硬顆粒飼料和發(fā)酵飼料購自市售某公司產(chǎn)品，將飼料粉碎過60目篩，制成2 mm沉性顆粒，風(fēng)干密封于-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料概略養(yǎng)分和氨基酸含量分別見表1和表2。

表1 試驗(yàn)飼料概略養(yǎng)分含量(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Proximate nutrients content of experimental feed（air-dry basis）%

表2 試驗(yàn)飼料氨基酸含量分析(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Analysis of amino acid content of test feed（dry matter basis）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取初始體重為（0.28±0.01）g的體質(zhì)健康、肢腳健全克氏原螯蝦幼蝦600尾，隨機(jī)分成2個處理組，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)100尾蝦，分別飼喂硬顆粒飼料和發(fā)酵飼料，試驗(yàn)期32 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)克氏原螯蝦研究基地進(jìn)行。在水泥池（2 m×1.5 m×1.25 m）池底鋪10 cm的土壤，種植1.5 m2水葫蘆和水花生，并泵入池塘水。試驗(yàn)每天13：00定時定點(diǎn)投喂，日投喂量為30 kg/hm2。試驗(yàn)期池水深50 cm，微孔增氧，水溫10～16℃，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L，溶氧 7～8 mg/L，pH 7.8～8。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)蝦禁食24 h，計(jì)數(shù)并稱重。每組隨機(jī)選取6尾幼蝦，取中腸道用于制作石蠟切片；另外每組選取12尾蝦，取其胃、肝胰腺和中腸，-20℃保存，用于酶活力測定。

1.5 分析測定

1.5.1 生長性能

存活率、增重率和特定生長率計(jì)算方法如下：

N0和Nt分別為試驗(yàn)開始和試驗(yàn)結(jié)束時的活蝦數(shù)量（尾）；W0和Wt分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時蝦的平均體重（g），t為試驗(yàn)時間（d），F(xiàn)為投餌量（g）。

1.5.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

將甲醛固定的腸道樣品進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、中性樹膠封片、蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察皺襞形態(tài)特征并拍照，用Digimizer軟件測量腸皺襞的高度、寬度和橫截面積。

1.5.3 酶活測定

胃、腸道和肝胰腺消化酶活力及抗氧化指標(biāo)均采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分類，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20.0軟件，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，作圖使用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦生長性能的影響

不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦生長性能的影響見表3，發(fā)酵飼料組幼蝦的末重、增重率和特定生長率顯著高于硬顆粒飼料組（P＜0.05），其中發(fā)酵飼料組幼蝦的末重、增重率和特定生長率分別比硬顆粒飼料組提高10.3%、18.4%和9.2%。發(fā)酵飼料組幼蝦的存活率比硬顆粒飼料組提高了6.3%，但差異不顯著（P＞0.05），發(fā)酵飼料組餌料系數(shù)顯著低于硬顆粒飼料組（P＜0.05）。

表3 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦生長性能的影響Table 3 Effects of different feeds on growth performance of juvenile Procambarus clarkii

2.2 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦消化能力的影響

2.2.1 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)

不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響見圖1和表4。從圖1可以看出，與硬顆粒飼料組相比，發(fā)酵飼料組蝦腸皺襞高度和寬度更高，梅花狀分支結(jié)構(gòu)更發(fā)達(dá)。從表4的定量分析可以看出發(fā)酵飼料組蝦腸皺襞高度和橫截面積顯著高于硬顆粒飼料組（P＜0.05），其中皺襞高度和橫截面積分別較硬顆粒飼料組提高了17.7%和13.1%。腸皺襞寬度也有提高趨勢，但二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（n=3）Figure 1 Effects of different feeds on intestinal morphology and structure of juvenile Procambarus clarkii（n=3）

表4 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Table 4 Effects of different feeds on intestinal morphology and structure of juvenile Procambarus clarkii

2.2.2 消化酶活力

不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦消化酶活力的影響見圖2?？耸显r胃組織中淀粉酶活力發(fā)酵飼料組與硬顆粒飼料組差異顯著（P＜0.05),但胃蛋白酶和脂肪酶活力差異不顯著（P＞0.05)：肝胰腺組織中胰蛋白酶和淀粉酶活力發(fā)酵飼料組與硬顆粒飼料組差異極顯著（P＜0.001),但脂肪酶活力差異不顯著（P＞0.05);腸道組織中胰蛋白酶活力發(fā)酵飼料組與硬顆粒飼料組差異極顯著（P＜0.01),但淀粉酶和脂肪酶活力差異不顯著（P＞0.05)。

圖2 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦消化酶活力的影響Figure 2 Effects of different feeds on digestive enzymes activity of juvenile Procambarus clarkii

2.3 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺抗氧化參數(shù)的影響見表5。發(fā)酵飼料組蝦肝胰腺丙二醛（MDA）和蛋白質(zhì)羰基（PC）含量顯著低于硬顆粒飼料組（P＜0.05）；總谷胱甘肽（T-GSH）含量，總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活力均顯著高于硬顆粒飼料組（P＜0.05）。

表5 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺抗氧化能力的影響Table 5 Effects of different feeds on hepatopancreas antioxidant parameters of juvenile Procambarus clarkii

3 討論

3.1 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦生長性能的影響

研究表明，優(yōu)質(zhì)飼料可以促進(jìn)動物消化器官的生長發(fā)育，從而提高養(yǎng)殖動物的消化能力[7]，蝦苗的健康成長同樣也需要適時地投放適宜的飼料[8]，克氏原螯蝦孵化出膜后，如果能及時得到適口且營養(yǎng)豐富的飼料，其生長速度將得到很大提升。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于硬顆粒飼料，發(fā)酵飼料顯著提高了克氏原螯蝦幼蝦的末體重、增重率和特定生長率，并且餌料系數(shù)顯著降低，發(fā)酵飼料可以提高幼蝦存活率但影響不顯著。許晨遠(yuǎn)等[9]研究也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充投喂適量發(fā)酵飼料可以顯著提高中華絨螯蟹幼蟹的特定生長率和增重率。表明在本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵飼料促進(jìn)幼蝦的生長。飼料經(jīng)發(fā)酵后其誘食性和適口性得以提高，促進(jìn)動物攝食[10]，且飼料在發(fā)酵過程中，一些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等在一系列生化反應(yīng)下被分解成小分子，更易于吸收[11]，因此，相比于硬顆粒飼料，發(fā)酵飼料具有更高的營養(yǎng)價值和易消化性[12]，這可能是發(fā)酵飼料促進(jìn)幼蝦生長的原因。本試驗(yàn)所用的發(fā)酵飼料中粗蛋白含量略高于硬顆粒飼料。蛋白質(zhì)水解后，發(fā)酵飼料中氨基酸總量低于硬顆粒飼料。有研究發(fā)現(xiàn)，豆渣經(jīng)發(fā)酵處理后提高了總游離氨基酸含量[13]。表明，發(fā)酵飼料可能通過提高游離氨基酸含量，提高克氏原螯蝦對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，促進(jìn)其生長。蝦的生長提高與其消化能力有著密不可分的聯(lián)系。楊奇慧等[14]研究指出，在凡納濱對蝦幼體整個發(fā)育過程中，胃蛋白酶和類胰蛋白酶活力呈上升趨勢，表明消化酶活力與中腸腺的發(fā)育程度有一定的關(guān)系。因而我們進(jìn)一步研究了不同飼料對幼蝦腸道形態(tài)和消化酶活力的影響。

3.2 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦消化能力的影響

腸道吸收面積可以反映動物的營養(yǎng)吸收能力，對動物的生長至關(guān)重要。腸皺襞的高度、寬度以及橫截面積是腸道吸收面積的3個重要指標(biāo)[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料組蝦腸皺襞高度和橫截面積顯著高于硬顆粒飼料組。關(guān)于發(fā)酵飼料對克氏原螯蝦腸道形態(tài)影響的研究還未見報道。在陸生動物上，發(fā)酵飼料可以提高豬和鵝的十二指腸絨毛高度[16-17]，雞的空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度比率和腸道微絨毛密度[18-19]。因此，發(fā)酵飼料可能通過提高克氏原螯蝦幼蝦的腸道吸收面積，從而提高其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，促進(jìn)其生長。其原因可能是飼料經(jīng)發(fā)酵處理后，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)利用率[20]；優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)[18]。

消化酶活力是動物消化能力的重要指標(biāo)?？耸显r消化液中含有蛋白水解酶、脂肪酶、淀粉酶、麥芽糖酶和蔗糖酶，其中胰蛋白酶和淀粉酶活力最高[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料提高了克氏原螯蝦幼蝦胃和肝胰腺組織的淀粉酶活力，肝胰腺和腸道組織的胰蛋白酶活力。王天神等[22]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料顯著提高了克氏原螯蝦（5.91 g）腸道的胰蛋白酶活力，與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。表明發(fā)酵飼料可能通過提高克氏原螯蝦幼蝦淀粉酶和胰蛋白酶活力，提高其對淀粉和蛋白質(zhì)的消化能力，從而促進(jìn)其生長。

3.3 不同飼料對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

肝胰腺是蝦體的代謝中心器官[23]，極易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致氧化損傷[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，能夠反映機(jī)體組織器官脂質(zhì)過氧化損傷程度[25]；PC則可以反映機(jī)體組織器官蛋白質(zhì)氧化損傷程度[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料組幼蝦肝胰腺的MDA和PC含量顯著低于硬顆粒飼料組。郭坤等[5]研究同樣發(fā)現(xiàn)飼料經(jīng)發(fā)酵處理后可以降低克氏原螯蝦肝胰腺M(fèi)DA含量。表明發(fā)酵飼料能降低脂質(zhì)和蛋白的氧化損傷程度。GSH是一種含巰基的三肽，將H2O2和脂質(zhì)過氧化物等有毒物質(zhì)分解為無害物質(zhì)，具有抗氧化和解毒作用[27]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，幼蝦肝胰腺中的TGSH含量顯著高于硬顆粒飼料組。表明發(fā)酵飼料可以通過提高幼蝦肝胰腺中的T-GSH含量，將H2O2有害物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的羥基化合物，從而保護(hù)幼蝦肝胰腺免受過氧化物的損傷。SOD、CAT、GST是生物體重要的抗氧化酶類，在保護(hù)機(jī)體組織器官免受氧化損傷中發(fā)揮著重要的作用[28]。SOD是減少機(jī)體氧化損傷的關(guān)鍵酶，在克氏原螯蝦的抗氧化及免疫系統(tǒng)中起著重要作用[29]。CAT可以保護(hù)生物體細(xì)胞和器官免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷[29]。GST可以催化H2O2的分解，從而清除自由基[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料組幼蝦肝胰腺中的T-SOD、CAT和GST活力均高于硬顆粒飼料組。與郭坤等[5]報道發(fā)酵飼料提高了克氏原螯蝦肝胰腺SOD和CAT活力一致。表明發(fā)酵飼料可以通過提高幼蝦肝胰腺中的T-SOD、CAT和GST活力，提高其抗氧化能力，保護(hù)肝胰腺免受氧化損傷。

4 結(jié)論

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，發(fā)酵飼料可以提高幼蝦腸皺襞高度和橫截面積，增加腸壁與食物的接觸面積；提高幼蝦肝胰腺中抗氧化酶活力和非酶物質(zhì)含量，增強(qiáng)肝胰腺抗氧化能力，降低脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷，保護(hù)肝胰腺健康，促進(jìn)肝胰腺消化酶分泌，提高消化酶活力，從而提高幼蝦腸道和肝胰腺的消化吸收能力，促進(jìn)其生長。