宋曉晶，熊 楓，賈術(shù)永，王廣軍，王淑友，王瑾玉，張維波

（中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京 100700）

通常認為，生命物質(zhì)的傳輸是由心血管構(gòu)成的循環(huán)系統(tǒng)完成的。心臟的節(jié)律性舒縮提供動力，驅(qū)動血液在動靜脈之間循環(huán)流動，動脈與靜脈之間的毛細血管將一部分血漿和其中的物質(zhì)濾出到組織間隙，與組織細胞交換物質(zhì)后，再通過毛細血管和毛細淋巴管回收到循環(huán)系統(tǒng)中［1］。近年的一些研究表明，血液物質(zhì)進入組織間隙形成的組織液可在間質(zhì)中流動，實現(xiàn)生命物質(zhì)和信息的傳輸，其流動路徑稱為間質(zhì)通道，該路線與中醫(yī)經(jīng)絡(luò)循行有一定的吻合［2］。組織液的流動服從達西定律，其流量與壓力梯度成正比，與組織的流阻成反比。以往的研究已證明經(jīng)脈線的皮下組織具有低流阻特性［3］，是小分子物質(zhì)循經(jīng)遷移的物理學條件，但造成低流阻特性的微觀結(jié)構(gòu)尚不明確［4］。常規(guī)形態(tài)學觀察時，間質(zhì)中的水會流失，可導致間質(zhì)結(jié)構(gòu)的“塌陷”，無法真實顯示活體組織的微觀結(jié)構(gòu)及其中組織液分布的特征［5］。本研究使用活體激光共聚焦成像技術(shù)，在體觀察大鼠腹內(nèi)壁中線熒光素鈉聚積部位的結(jié)構(gòu)，以了解活體間質(zhì)通道的微觀結(jié)構(gòu)和組織液的分布。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

健康成年SD大鼠5只，平均年齡5～7周，體重280～300 g，雄性，由中國軍事醫(yī)學科學院動物中心提供［許可證：SCXK-（軍）2011-004］。本研究的試驗方案已通過中國中醫(yī)科學院針灸研究所動物倫理委員會審查批準，所有大鼠均按試驗動物飼養(yǎng)和使用的國際標準對待。

1.1.2 試驗儀器

小動物活體激光共聚焦成像系統(tǒng)（ViewnVivoB30，OptiScan公司，澳大利亞），全自動多功能全景組織細胞掃描分析系統(tǒng)（奧林巴斯VS 120，日本），數(shù)碼相機（Nikon D5000，帶105 mm微距鏡頭，日本），窄帶濾色鏡（i-boxine，PHDYUV62mm，日本），600EXⅡ-RT閃光燈（Canon，日本）。

1.2 試驗方法

1.2.1 熒光素鈉注射

用2%的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射對大鼠進行麻醉，待大鼠充分麻醉后，將其按仰臥位固定在試驗臺上。將熒光素納染料（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用注射用生理鹽水配制成10%的溶液，按0.1 mL/kg的劑量對大鼠進行尾靜脈注射。

1.2.2 熒光照相法采集腹內(nèi)壁的直觀圖像

熒光染料注射2～3 min后，將大鼠仰臥位放置于試驗臺上，沿大鼠腹部劍突一線做橫行切口，并向尾部做U型切口，暴露腹內(nèi)壁組織，用消毒脫脂棉擦凈腹內(nèi)壁組織表面滲出物。用本實驗室創(chuàng)建的熒光照相法拍攝腹內(nèi)壁的圖像，觀察腹內(nèi)壁表面的熒光分布特征。

1.2.3 活體激光共聚焦成像檢測方法和圖像分析

將活體激光共聚焦成像系統(tǒng)的掃描探頭垂直放置在大鼠腹內(nèi)壁中線表面，根據(jù)成像圖片質(zhì)量調(diào)試掃描深度和激光功率，觀察、采集大鼠腹中線上a、b和c共3點的活體激光共聚焦成像圖；并采集腹中線上這3個點水平旁開1 cm處腹壁組織d、e和f這3個點的成像圖。此外，以與腹中線b點水平右側(cè)3 mm處為起點，每3 mm為一個間隔，水平向左移動，共采6個點的圖像。用激光共聚焦成像系統(tǒng)軟件分析圖像視野中活體組織的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.4 腹內(nèi)壁組織Masson染色觀察

以腹中線上的觀察點a為中心切取長約1.0 cm、寬約1.0 cm、厚約0.5 cm的腹壁組織，固定包埋，做成5 μm厚的石蠟切片，做Masson染色，在顯微鏡下觀察腹中線組織與旁開組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腹內(nèi)壁表面的熒光素鈉分布特征

肉眼可見大鼠腹內(nèi)壁表面光滑，壁層表面分布著多條小血管，其中一條沿腹中線縱行分布，在此血管兩側(cè)有少量的脂肪組織（圖1a）。熒光照相結(jié)果顯示，大鼠尾靜脈熒光素鈉溶液注射后，在腹內(nèi)壁表面出現(xiàn)熒光染料聚集分布的高亮條帶。其中，以沿腹內(nèi)壁中線位置出現(xiàn)的條帶最明顯；此外，在腹內(nèi)壁中線兩側(cè)還各分布有2條較細的亮線（圖1b）。

圖1 尾靜脈注射熒光素鈉后大鼠腹內(nèi)壁組織的熒光照相圖Fig. 1 Fluorograph of internal abdominal wall tissue in rats after fluorescein sodium injection through caudal vein

2.2 大鼠腹內(nèi)壁中線組織的活體激光共聚焦成像特征

在活體共聚焦成像圖中，白亮色區(qū)反映熒光染料溶液分布或浸染的區(qū)域，白色越多、越亮，代表含有熒光素鈉的組織液越多；暗色區(qū)反映各種實體組織、細胞結(jié)構(gòu)。

在檢測深度為3 μm、激光功率為70 μW的條件下可觀察到：在成像區(qū)域中沿腹內(nèi)壁中線方向走行的較粗的黑色管狀物，對比實體組織，其為沿腹內(nèi)壁中線上分布的血管；在血管兩邊分布著大量與腹中線平行、有序排列的線狀結(jié)構(gòu)，可能為纖維結(jié)締組織，此區(qū)域的背景較亮，表明在這一組織中熒光染料和組織液較多；亮白色均為分布在這些纖維間隙中混有熒光素鈉的組織液。此外，還零星出現(xiàn)暗色不規(guī)則的類圓形結(jié)構(gòu)，為脂肪細胞（圖2a、2c）。綜上，在大鼠腹內(nèi)壁中線上各點組織的共聚焦成像圖中（圖2），主要為血管和纖維結(jié)締組織。由于活體組織具有彈性和黏性，在腹內(nèi)壁中線上a、b和c點移動探頭，共聚焦成像圖中的微觀組織結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)一定的位移。

2.3 大鼠腹內(nèi)壁中線旁開組織的活體激光共聚焦成像特征

以相同的檢測參數(shù)觀察到，在大鼠腹內(nèi)壁中線上各點水平向左側(cè)旁開3 mm處的組織，即圖1a中的d、e、f點，其成像視野中出現(xiàn)大片的黑色區(qū)域，亮白區(qū)域比腹中線組織減少，圖像顯示主要是平行排列的粗細不等的黑色條帶，其應(yīng)為肌纖維；在肌纖維間隙中分布著白亮細線，為填充在肌間隙的組織液；其表面分布著與肌纖維走行基本垂直的纖維組織（圖2 d～2f）。

在腹正中線b點的右側(cè)，水平向左平移探頭，可發(fā)現(xiàn)圖像視野中出現(xiàn)大量縱行排列有序的纖維結(jié)構(gòu)（圖3a）；緊接著出現(xiàn)了和圖2a中特征一致的結(jié)構(gòu)，即縱行分布的纖維組織和血管，圖像中右側(cè)部分的亮白區(qū)域應(yīng)該是組織間隙，其中充滿大量含熒光素鈉的組織液（圖3b、3c）；當探針從正中線上平移到旁開組織，亮白區(qū)域消失，組織中組織液含量逐漸減少，出現(xiàn)較粗的排列有序的肌纖維，表面分布有平行排列的纖維結(jié)締組織（圖3d～3f）。

圖2 大鼠腹內(nèi)壁中線及其旁開組織的活體激光共聚焦圖像（1 000×）Fig. 2 In vivo confocal laser imaging of the midline and side open tissue of internal abdominal wall tissue in rats（1 000×）

圖3 大鼠腹內(nèi)壁中線向左至水平旁開組織的活體激光共聚焦連續(xù)觀察圖像（1 000×）Fig. 3 In vivo confocal laser imaging from the midline to side open tissue of internal abdominal wall tissue in rats（1 000×）

2.4 大鼠腹內(nèi)壁腹中線組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

大鼠腹內(nèi)壁組織Masson染色結(jié)果顯示：在與腹內(nèi)壁表面平行的組織切片中可以觀察到，腹中線位置為藍染的沿中線縱行分布的纖維結(jié)締組織，纖維間的間隙較大；腹中線纖維組織兩邊為大量有序的緊密排列的肌纖維（圖4a）。在腹中線結(jié)締組織與旁開的肌組織之間有較大的間隙（圖4b），在活體組織中這些間隙里應(yīng)該填充著組織液。組織切片顯示大鼠腹內(nèi)壁中線與旁開組織的結(jié)構(gòu)特征與活體激光共聚焦成像結(jié)果吻合。

圖4 大鼠腹內(nèi)壁中線和旁開組織的Masson染色Fig. 4 The Masson stain of the midline and the lateral opening tissue of internal abdominal wall tissue in rats

3 討論

活體激光共聚焦成像是在傳統(tǒng)的電子內(nèi)鏡基礎(chǔ)上整合了共聚焦激光顯微鏡而成的，可對組織進行一定深度的斷層掃描成像，并能排除聚焦平面之外組織的干擾，具有放大 1 000 倍的能力，可以亞微米的高分辨率實時精準捕捉活體組織成像［6］。它可將探頭以極低的侵入程度送達任何器官或深層組織進行顯微成像研究，從外周組織、內(nèi)臟器官到中樞，活體共聚焦成像系統(tǒng)可將光線帶到其他顯微鏡無法抵達的區(qū)域，能夠在活體組織水平提供細胞及亞細胞層面完整的高分辨率實時影像，實現(xiàn)活體狀態(tài)下實時、動態(tài)的組織結(jié)構(gòu)成像、細胞和分子事件的監(jiān)測追蹤等［7］。同時，避免了離體切片染色造成的真實組織結(jié)構(gòu)破壞和物質(zhì)成分的流失，尤其適用于活體組織空間結(jié)構(gòu)和組織液分布特征的可視化觀察顯示。目前，此技術(shù)已經(jīng)在組織微區(qū)高分辨成像［8］、組織分子和微血管事件追蹤［9］、癌細胞轉(zhuǎn)移追蹤［10］等方面開展了應(yīng)用。

本團隊在小型豬、大鼠和人體沿中醫(yī)經(jīng)脈循行線的位置，檢測到了具有低流阻特性的間質(zhì)通道［11］，并通過注射示蹤劑顯示了其循行軌跡［12-13］。但由于缺乏可觀察活體間質(zhì)通道微觀結(jié)構(gòu)和充填在結(jié)構(gòu)中的組織液的影像學技術(shù)，影響了對循經(jīng)低流阻間質(zhì)通道的組織結(jié)構(gòu)特征及其生物學功能的進一步探索研究。2018年，美國有研究團隊應(yīng)用活體激光共聚焦內(nèi)窺鏡觀察到了人體多個組織的間質(zhì)結(jié)構(gòu)特征，以及其中充填的液態(tài)組織液［5］，為活體間質(zhì)和組織液的觀察研究提供了優(yōu)勢技術(shù)支持。近期，本團隊引進了小動物活體激光共聚焦成像這一先進技術(shù)，應(yīng)用此技術(shù)在體觀察了大鼠腹壁中線組織，即傳統(tǒng)中醫(yī)任脈循行部位的微觀結(jié)構(gòu)，觀察到在大鼠腹壁正中線組織中存在比周圍非經(jīng)組織較大的組織間隙和較多的組織液，認為其是機體的間質(zhì)通道［14］。為進一步探索富含組織液的間質(zhì)通道的微觀結(jié)構(gòu)特征，本研究又對大鼠腹內(nèi)壁組織進行了活體微觀結(jié)構(gòu)觀察。

本團隊提出了組織液流場模型［3］，“水指示劑”熒光素鈉尾靜脈注射后，通過血液循環(huán)分布到組織中，成為組織液［15］，按照組織液流場模型可向間隙較多且流阻較低的大間隙匯聚。本研究用熒光照相觀察到，大鼠尾靜脈注射熒光素鈉1～2 min后，熒光素鈉可在腹中線聚積，并在腹內(nèi)壁表面正中呈現(xiàn)寬約2 mm的亮帶。使用活體激光共聚焦成像儀對腹內(nèi)壁中線的熒光亮帶進行觀察后發(fā)現(xiàn)，該亮帶主要由大量平行纖維組成，其纖維排列方向基本與亮帶即大鼠的身體長軸平行。腹內(nèi)壁中線的成像背景亮度較高，表明其中熒光素鈉含量豐富，即這些纖維組織中組織液含量較高。在腹內(nèi)壁中線旁開的區(qū)域，纖維組織數(shù)量減少，而且多數(shù)纖維的走行與身體長軸接近垂直，纖維組織的下層為密集排列的肌肉組織。活體共聚焦成像觀察到腹內(nèi)壁中線組織的微觀結(jié)構(gòu)特征與組織取材后Masson染色的結(jié)果一致，腹內(nèi)壁中線是與身體長軸走行一致的間隙較大的纖維結(jié)締組織，中線兩邊為致密的肌肉組織。在這些實體組織的間隙中，應(yīng)為大量組織液存在和流動的部位。

本研究應(yīng)用活體激光共聚焦成像技術(shù)首次顯示了大鼠腹內(nèi)壁富含組織液的間質(zhì)通道，其微觀結(jié)構(gòu)特征為較多的纖維成分，且纖維排列與身體長軸平行。根據(jù)組織液流變學特性，大鼠腹內(nèi)壁中線長程、平行排列且有間隙的纖維組織這一結(jié)構(gòu)特性有利于機體組織液流動，可構(gòu)成組織液流動的低流阻優(yōu)勢通道。此前，有學者使用正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）等技術(shù)發(fā)現(xiàn)在針刺得氣部位存在平行的毛細血管和膠原纖維［16］；還有學者運用計算機數(shù)值模擬證實在穴位周圍分布的平行纖維結(jié)構(gòu)有利于組織液的流動［17］。此外，有學者已觀察到機體存在具有組織液流動的優(yōu)勢界面，這一界面存在于血管外、皮下等組織間隙，具有一定的結(jié)構(gòu)學特征［18］。本研究使用活體可視化技術(shù)，在大鼠腹內(nèi)壁中線任脈間質(zhì)通道上觀察到大量平行纖維結(jié)構(gòu)特征，與上述研究結(jié)果相吻合，為組織液向腹中線匯聚并循任脈間質(zhì)通道流動提供了組織形態(tài)學基礎(chǔ)，也為進一步認識間質(zhì)通道的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的研究技術(shù)和試驗證據(jù)，推進了中醫(yī)經(jīng)絡(luò)生物學內(nèi)涵的研究。