casper斑馬魚體色觀察及過表達(dá)mitfa對(duì)其體色發(fā)育的影響

張廣婧，王 梅，劉利生，張永勤，彭亮躍，劉文彬，肖亞梅，劉錦輝

（省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081）

魚類主要通過幾種色素細(xì)胞將色素保留在細(xì)胞內(nèi)從而形成特定的圖案和體色［1-3］。魚類的不同體色主要取決于鱗片和皮膚含有的色素細(xì)胞及其不同的數(shù)量分布，魚鰭和鱗片都是皮膚的衍生物，所以魚類的體色觀察常以魚鰭和鱗片為材料［4］。在魚類中色素細(xì)胞有黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞六種［5-6］。2017年，林金杏等［7］研究報(bào)道了野生型斑馬魚體表有黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞三種類型色素細(xì)胞，但鰭和鱗片在色素細(xì)胞組成和分布上存在著差異，鱗片中色素細(xì)胞的種類和形態(tài)特征較鰭中色素細(xì)胞更豐富。目前，對(duì)于硬骨魚類體色的報(bào)道鮮少，尤其是斑馬魚其他品系。nacre斑馬魚品系［8］由mitfa基因突變而來，而roy orbin斑馬魚品系［9］則是因?yàn)榫幋a線粒體內(nèi)膜蛋白的mpv17基因內(nèi)含子缺陷所導(dǎo)致的。casper突變體是一種nacre與roy orbin雜交選育得到的雙基因突變斑馬魚品系（mitfaw2/w2;roya9/a9）［10-11］。casper斑馬魚的特點(diǎn)是全身透明無黑色素細(xì)胞，是較為優(yōu)選的魚類試驗(yàn)材料，但對(duì)于其體色的研究資料尚未完善。

處在真皮層的黑色素細(xì)胞在特定的細(xì)胞器——黑素體中將酪氨酸通過酪氨酸酶的作用氧化成多巴，隨后發(fā)生異構(gòu)化和脫羧等作用，生成為5，6-二羥基吲哚（5，6-dihydroxyindole，DHI），再經(jīng)過一系列復(fù)雜的氧化反應(yīng)最終產(chǎn)生吲哚聚合體，即黑色素［10］。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphtalmiaassociated transcription factor，MITF）的基因在斑馬魚中存在mitfa和mitfb兩個(gè)亞型，mitfa是檢測(cè)具有多種分化潛能的神經(jīng)嵴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為黑色素細(xì)胞時(shí)的標(biāo)記基因之一，并且在黑色素細(xì)胞分化、遷移的過程中發(fā)揮著決定性的作用［13-14］。已有研究表明：Wnt基因主要與黑色素細(xì)胞的分化有關(guān)，參與早期神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成黑色素細(xì)胞；Wnt 通路主要是通過上游基因系列反應(yīng)，使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累，稍后通過與LEF（lymphoid enhancing factor）結(jié)合，啟動(dòng)LEF與MITF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而激活MITF的表達(dá)，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的分化或黑色素的生成［15］。mitfa基因一方面受MC1R/ASIP/a-MSH、Wnt/β-Catenin及c-Kit/SCF信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，另一方面通過bHLHZip結(jié)構(gòu)域與酪氨酸基因家族啟動(dòng)子的E-box以及M-box (CAT-GTG)結(jié)合后激活相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的生成［16-17］。而且MITF還能影響周期素依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，cdk2）、T-box 轉(zhuǎn)錄因子2（T-box transcription factor 2，tbx2）和周期素依賴性激酶抑制因子p21等來調(diào)控黑色素細(xì)胞的生長發(fā)育［4］。2005年，姚紀(jì)花等［18］的研究中干擾了mitfa基因，導(dǎo)致體表黑色素細(xì)胞減少。除此之外，較多的研究表明mitfa的突變都會(huì)導(dǎo)致黑色素細(xì)胞發(fā)生變化。但對(duì)于mitfa基因的過量表達(dá)并未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過在casper透明斑馬魚中過表達(dá)mitfa基因，同時(shí)觀察比較分析野生型斑馬魚、casper斑馬魚以及過表達(dá)mitfa的casper斑馬魚之間在體色發(fā)生的不同時(shí)期和不同組織中色素細(xì)胞的差異變化，探討mitfa基因的表達(dá)與斑馬魚體色變異的關(guān)系，從而為魚類體色變異的分子機(jī)制研究和觀賞魚類品種體色遺傳選育改良提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用野生型AB斑馬魚（Danio rerio）和casper斑馬魚均來自中科院水生所國家斑馬魚資源中心。

1.2 野生型斑馬魚和casper斑馬魚魚鰭、鱗片的取樣與色素細(xì)胞的觀察

將野生型斑馬魚和casper斑馬魚用MS-222麻醉后，使用經(jīng)75%酒精消毒后的手術(shù)剪刀于體視顯微鏡下分別完整剪取臀鰭和背鰭，并用消毒過的鑷子輕輕夾取鰭條基部附近的鱗片。因斑馬魚鰭條與鱗片較薄且透明，在經(jīng)過生理鹽水清洗干凈后，可置于載玻片上制成臨時(shí)玻片，使用體視顯微鏡觀察玻片并對(duì)色素細(xì)胞的形態(tài)和分布進(jìn)行記錄。

1.3 casper斑馬魚胚胎的獲取與其早期發(fā)育過程體色的觀察

取性成熟的casper斑馬魚，將雌魚和雄魚分別置于催產(chǎn)盒中，并用隔板隔開，避光置于28.5℃下過夜。第二天早上給予光照刺激并撤去隔板，待產(chǎn)卵后，收集得到胚胎。將胚胎清洗后在體視顯微鏡下觀察其在不同胚胎發(fā)育過程中以及幼苗出膜后體色的變化。

1.4 mitfa基因的過表達(dá)

首先使用HiPure Total RNA Midi Kit RNA提取試劑盒（Magen公司，R4124）進(jìn)行斑馬魚胚胎RNA的提取，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司，RR047A）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到斑馬魚cDNA。根據(jù)NCBI基因庫中上傳的斑馬魚mitfa基因序列（NM_130923）篩選得到其MITF的蛋白編碼區(qū)（coding sequence，CDS）比較過表達(dá)所選擇的質(zhì)粒載體與基因序列，篩選得到Hind III與NheI雙酶切位點(diǎn)。使用引物設(shè)計(jì)原則在CDS區(qū)上下游兩端設(shè)計(jì)帶有人工添加酶切位點(diǎn)的引物。以反轉(zhuǎn)錄得到的斑馬魚cDNA為模板，加入設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段。將其與p-Tol2-EGFP質(zhì)粒載體進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒p-Tol2-mitfa過表達(dá)重組質(zhì)粒。在顯微注射儀上將所構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒顯微注射casper斑馬魚胚胎，顯微注射的質(zhì)粒的質(zhì)量濃度控制在100～200 ng/μL之間，并且注射p-Tol2-EGFP質(zhì)粒載體作為對(duì)照，之后在熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 casper斑馬魚體色的色素細(xì)胞觀察

野生型斑馬魚的魚鰭分為具有條紋的魚鰭和無條紋的魚鰭兩種，例如，臀鰭和尾鰭具有條紋，而背鰭、胸鰭、腹鰭沒有條紋。本文分別選擇了具有條紋的臀鰭和無條紋的背鰭的野生型（wild type，WT）斑馬魚與casper斑馬魚進(jìn)行對(duì)比觀察（圖1）。在顯微鏡下觀察到casper斑馬魚的臀鰭處由黃色和橙黃色的黃色素細(xì)胞疏密分布形成黃色條紋（圖2a），背鰭上則均勻地分布著大量黃色素細(xì)胞（圖2b），而casper斑馬魚背部鱗片中，僅可見部分黃色素細(xì)胞，而無黑色素細(xì)胞（圖2c）。此外，觀察到野生型斑馬魚與casper斑馬魚在體色上存在顯著的差異，但無論是野生型斑馬魚還是casper斑馬魚，黃色素細(xì)胞在背鰭上呈顆粒狀，在背部鱗片上呈現(xiàn)出樹突狀。

圖1 野生型斑馬魚和casper斑馬魚臀鰭、背鰭、背部鱗片觀察點(diǎn)Fig. 1 Observation points of wild-type zebrafish and casper zebrafish anal fin, dorsal fin, and back scales

圖2 野生型斑馬魚和casper斑馬魚臀鰭、背鰭、背部鱗片色素細(xì)胞觀察Fig. 2 Observation of pigment cells in anal, dorsal and dorsal scales of wild-type zebrafish and casper zebrafish

2.2 casper斑馬魚早期體色發(fā)育的觀察

比較野生型斑馬魚與casper斑馬魚（圖3），發(fā)現(xiàn)兩者在發(fā)育過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著差別，在體色發(fā)育過程中明顯觀察到野生型斑馬魚有黑色素細(xì)胞的分布以及產(chǎn)生的系列變化（圖3紅箭頭所指），而在casper斑馬魚中其體色大多數(shù)是由黃色和橙黃色的黃色素細(xì)胞疏密分布形成黃色條紋，并未觀察到黑色素細(xì)胞的存在。

圖3 野生型斑馬魚與casper斑馬魚早期體色發(fā)育觀察Fig. 3 Observation of early body color development of wild-type zebrafish and casper zebrafish

2.3 過表達(dá)mitfa的casper斑馬魚早期體色發(fā)育觀察

首先，獲得斑馬魚的總cDNA。比較過表達(dá)所選擇的質(zhì)粒載體與基因序列，在CDS區(qū)上下游兩端設(shè)計(jì)帶有人工添加酶切位點(diǎn)（Hind III與NheI雙酶切位點(diǎn)）的引物，通過PCR擴(kuò)增得到mitfa基因（帶有雙酶切位點(diǎn)）目的片段（大約1.3 kb）。將其與p-Tol2-EGFP質(zhì)粒載體進(jìn)行連接得到p-Tol2-mitfa過表達(dá)重組質(zhì)粒（圖4a）。使用顯微注射的方式將p-Tol2-mitfa過表達(dá)重組質(zhì)粒注射進(jìn)casper斑馬魚一細(xì)胞期的胚胎，進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。每次注射對(duì)照組（注射p-Tol2-EGFP質(zhì)粒載體）和試驗(yàn)組（注射p-Tol2-mitfa過表達(dá)重組質(zhì)粒）所用胚胎都在200枚左右，胚胎存活率達(dá)到95%左右，重組質(zhì)粒成功進(jìn)入胚胎且過表達(dá)的效率在70%左右（表1），最終得到過表達(dá)mitfa的casper斑馬魚。將注射p-Tol2-EGFP質(zhì)粒載體的casper斑馬魚一細(xì)胞期胚胎作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)兩者在發(fā)育時(shí)期形態(tài)特征并未有差異（圖4b），但體色方面與對(duì)照組不同的是，過表達(dá)mitfa的casper斑馬魚孵化后2天（2 days post-hatching，2 dph）在頭背部、腹部與軀干部（紅箭頭所指）有樹突狀和顆粒狀的黑色素細(xì)胞重新形成，并且在50 dph時(shí)黑色素細(xì)胞一直存在（圖4c）。

圖4 casper斑馬魚mitfa過表達(dá)Fig. 4 mitfa overexpression of casper zebrafish

表1 胚胎注射情況統(tǒng)計(jì)Tab. 1 Embryo injection statistics

3 討論

魚類具有豐富多彩的體色，這在躲避敵害、覓食、求偶交配等種群繁衍中發(fā)揮著重要作用，并且蘊(yùn)藏著十分可觀的生態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)效益［2-3］。色素細(xì)胞是魚類形成五彩斑斕的色素斑圖與體色的基礎(chǔ)，不同的色素細(xì)胞種類、數(shù)量和分布通過影響特定波長光的吸收和反射，從而產(chǎn)生特定的體色［16］。黑色素細(xì)胞在魚類生理性體色變化中起主要作用，所以目前對(duì)于黑色素細(xì)胞的研究最為廣泛［19-20］。斑馬魚作為試驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，被廣泛應(yīng)用于各種生物學(xué)科研究。在前期文獻(xiàn)報(bào)道中，野生型斑馬魚眼部和頭背部黑色素細(xì)胞呈樹突狀、顆粒狀、團(tuán)狀和彌散狀［7］。本研究以斑馬魚的體色特點(diǎn)作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)野生型斑馬魚與casper斑馬魚在胚胎和幼苗的形態(tài)結(jié)構(gòu)上并未有太大的差異，而在組織細(xì)胞層面和早期體色發(fā)育過程中存在著顯著差異。在casper斑馬魚中發(fā)現(xiàn)其體色大多數(shù)為黃色和橙黃色細(xì)胞，并無黑色素細(xì)胞。casper斑馬魚的臀鰭處是由黃色和橙黃色的黃色素細(xì)胞疏密分布形成黃色條紋，背鰭上則均勻地分布著大量顆粒狀黃色素細(xì)胞，而背部鱗片中，僅可見部分黃色素細(xì)胞，并且黃色素細(xì)胞均呈現(xiàn)出樹突狀分布。casper斑馬魚不僅是魚類體色發(fā)育研究重要材料，而且因成體透明，在顯微鏡下可直接示蹤觀察細(xì)胞。透明斑馬魚casper突變體的構(gòu)建，極大地推動(dòng)了成年斑馬魚移植模型可視化的發(fā)展。在casper斑馬魚體內(nèi)植入RAS-黑色素瘤細(xì)胞，5 d后即可觀察到腫瘤的移植、擴(kuò)增和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移［17］。這為脊椎動(dòng)物的干細(xì)胞移植和癌癥體內(nèi)研究提供了材料平臺(tái)，在神經(jīng)科學(xué)、干細(xì)胞移植和腫瘤研究中有極大的應(yīng)用。

mitf基因在斑馬魚中存在mitfa和mitfb兩個(gè)亞型，mitfa與黑色素細(xì)胞形成密切相關(guān)，而mitfb只與眼視網(wǎng)膜色素上皮的發(fā)育有關(guān)［13-14］。mitfa的表達(dá)受到Ednrb、Wnt及Kit/SCF信號(hào)通路的調(diào)控，其翻譯得到的MITF通過自身的堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可以與酪氨酸基因家族啟動(dòng)子結(jié)合，從而激活相關(guān)基因如酪氨酸酶、多巴素異構(gòu)酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的生成［17］。本研究通過在casper斑馬魚中過表達(dá)mitfa基因，發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞在斑馬魚幼魚時(shí)期就有表達(dá)，并且在50 hfp后黑色素細(xì)胞還一直存在。黑色素細(xì)胞的形成受一系列信號(hào)通路和基因的嚴(yán)格調(diào)控，其中，MC1R/α-MSH 信號(hào)通路、PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、WNT /β-catenin 信號(hào)通路、NO 信號(hào)通路為最常見的5條信號(hào)通路［21-22］。mitfa基因作為這5條通路共有的靶向基，其過量表達(dá)具體參與哪條通路進(jìn)而影響黑色素細(xì)胞的出現(xiàn)需進(jìn)一步探索。前期研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚黑色素細(xì)胞與黃色素細(xì)胞來自于同一前體干細(xì)胞，且mitfa基因還參與虹彩細(xì)胞的發(fā)育過程。但本研究發(fā)現(xiàn)原本黑色素細(xì)胞缺失的casper斑馬魚在頭背部以及腹部有樹突狀與顆粒狀黑色素細(xì)胞的產(chǎn)生，且黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞沒有變化［23］。mitfa基因參與黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞的調(diào)控需要進(jìn)一步的研究。本研究得到的過表達(dá)mitfa的casper斑馬魚為深入開展魚類體色分子調(diào)控機(jī)制研究提供了材料平臺(tái)。mitfa作為黑色素相關(guān)的關(guān)鍵基因，其研究對(duì)黑色素細(xì)胞本身和黑色素形成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響以及觀賞魚類新品種的選育、魚類資源的開發(fā)利用和保護(hù)均具有十分重大的意義。