ChIL-2-ChIL-4融合基因重組質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性研究

鄭龍龍 ，張 黎 ，郝思源，郝飛飛，白 瑞，霍乃蕊，鄭明學(xué)，譚 凡

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）作為細(xì)胞因子的一員，是家禽機(jī)體固有免疫調(diào)節(jié)和特異性免疫啟動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)。生物活性的IL-2和IL-4蛋白可通過增強(qiáng)目前常見的各類型商品化疫苗免疫反應(yīng)的過程，誘導(dǎo)產(chǎn)生更加快速、高效、持久的中和抗體，作為一種新的免疫增強(qiáng)劑在疫苗研究領(lǐng)域受到廣泛研究與應(yīng)用。

2018年，本課題組成員貢鑫等［1］成功構(gòu)建了ChIL-2和ChIL-4的融合基因表達(dá)載體 pCI-ChIL-2-ChIL-4-EGFP，作為雞球蟲病三價(jià)四株早熟弱毒活疫苗的免疫佐劑。該載體表達(dá)分泌的ChIL-4-ChIL-2融合蛋白可增強(qiáng)雞球蟲病活疫苗的免疫保護(hù)力，降低活疫苗的副作用。

生物制品從微量的試驗(yàn)階段進(jìn)入商業(yè)化批量生產(chǎn)階段，最終進(jìn)入復(fù)雜的田間應(yīng)用階段，須驗(yàn)證種質(zhì)庫資源是否能夠保持安全、穩(wěn)定、質(zhì)量可控的狀態(tài)［2］。因此，本文通過研究DH5α/pUC57 pCIChIL-2-ChIL-4-EGFP重組菌的形態(tài)、生化特性、質(zhì)粒丟失率、質(zhì)粒超螺旋比、目的基因穩(wěn)定性等指標(biāo)，對(duì)后續(xù)大規(guī)模的生產(chǎn)研究及產(chǎn)品質(zhì)量控制的建立提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，對(duì)潛在的田間應(yīng)用具有指導(dǎo)性意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DH5α/pUC57 重組菌和 pCI-ChIL-2-ChIL-4-EGFP重組質(zhì)粒由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。EcoRI （TaKaRa，AGZ0312A）、SalI （Ta-KaRa，AGY1010A）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司，D629KA5985］、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific， MultiskanTMFC )、 PCR儀(Bio-Rad，S1000TM）、內(nèi)毒素檢測(cè)儀（安度斯生物有限公司，S-0704）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株傳代

DH5α/pUC57 重組菌使用接種環(huán)劃線接種于無菌37℃ 溶菌肉湯(lysogeny broth，LB )平板，避光倒置培養(yǎng)12 h，選取單個(gè)菌落混合10.0 mL含Amp＋（Ampicillin）的LB液體培養(yǎng)基，作為原始菌（0代）；抽取重組菌菌液0.5 mL混合于50.0 mL無菌LB Amp＋液體培養(yǎng)基，37℃避光220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，連續(xù)傳30 代。

1.2.2 重組菌株遺傳穩(wěn)定性鑒定

取5×n（n=0～6）代重組菌，通過革蘭氏染色和特定糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定重組菌的形態(tài)和生化特性。

1.2.3 重組菌純粹性檢驗(yàn)

根據(jù)《中國(guó)獸藥典》純粹性檢驗(yàn)方法［3］，無菌固體LB/GP斜面培養(yǎng)基試管涂布0.2 mL菌液，無菌條件下分別置于37℃和25℃避光培養(yǎng)。

1.2.4 重組菌分子生物學(xué)鑒定

由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)DH5α工程菌16S rDNA序列合成引物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R ：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′［4］。使用DNA提取試劑盒提取總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目標(biāo)大小為1.2 kb的宿主菌序列，陽性產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線工具進(jìn)行序列比對(duì)，同源性大于95% 時(shí)判定為大腸桿菌屬［5］。

取5×n（n=0～6）代的重組菌菌液2.0 mL提取重組質(zhì)粒，按酶切試劑說明書配置酶切體系，37℃水浴 15 min，酶切產(chǎn)物在120 V電壓下經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳20 min后進(jìn)行檢測(cè)。通過Image Lab 4.1軟件計(jì)算重組質(zhì)粒的超螺旋體質(zhì)粒及各類質(zhì)粒構(gòu)型的圖像像素點(diǎn)的比值，得出超螺旋體質(zhì)粒在總質(zhì)粒量的百分比；并對(duì)質(zhì)粒目的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與ChIL-2和ChIL-4基因比對(duì)。

1.2.5 重組質(zhì)粒丟失率檢測(cè)

參考吳昊［6］完善的檢測(cè)DH5α/pUC57 重組菌質(zhì)粒丟失率的方式，隨機(jī)選擇100個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的單個(gè)菌落，接種于含Amp＋的無菌LB 固體培養(yǎng)皿上，37℃條件下無菌培養(yǎng)12 h。統(tǒng)計(jì)無污染的目的菌落數(shù)量，按以下公式計(jì)算質(zhì)粒丟失率：

質(zhì)粒丟失率=（100-平板上菌落數(shù)）/100×100%。

1.2.6 重組質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)效果測(cè)定

生物安全柜內(nèi)吹打豬睪丸細(xì)胞（swine testis，ST)制成細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞培養(yǎng)板（24 孔）接種1.0×105個(gè)細(xì)胞，37℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)， 貼壁率達(dá)到80%～90% 時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為空白組、空載組、試驗(yàn)組。棄掉培養(yǎng)液，用無血清DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養(yǎng)液洗2 次，V（重組質(zhì)粒）∶V（HilyMax轉(zhuǎn)染試劑）=1∶3 緩緩混勻，室溫靜置15 min，混合物均勻加入細(xì)胞孔中。加入質(zhì)粒后 37℃孵育4 h，替換無抗生素的含5%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光信號(hào)（觀察時(shí)間<30 min）。以Image J軟件分析視野中綠色熒光的累積光密度值作為融合蛋白表達(dá)量的指標(biāo)，綠色熒光信號(hào)的百分比平均值作為ST細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。

1.2.7 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物生物活性測(cè)定

無菌分離10日齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雛雞脾臟淋巴細(xì)胞，每孔1.0×107個(gè)細(xì)胞分裝入6孔板，然后每孔加入1.0 mg/mL ConA 40.0 μL培養(yǎng)48 h。離心收集細(xì)胞，用RPIM（Roswell Park Memorial Institute）1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，96孔板每孔加入2.5×105個(gè)細(xì)胞，空白組不加細(xì)胞；試驗(yàn)組加入含質(zhì)粒的ST細(xì)胞上清液50.0 μL；細(xì)胞對(duì)照組加入50.0 μL 空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液；空白組加50.0 μL RPMI 1640+50 μL DMEM培養(yǎng)基。上述細(xì)胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)36 h后，每孔加入四甲基偶氨唑鹽 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）10.0 μL混勻，常溫避光靜置孵育4 h，震蕩后混勻用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的光密度（optical density，OD）。MTT結(jié)果以刺激指數(shù)（lymphocyte stimulation index，SI）表示，SI的計(jì)算公式為 ：SI=（試驗(yàn)組OD490nm-空白組OD490nm）/（細(xì)胞對(duì)照組OD490nm-空白組OD490nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 純粹性

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管與流體葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基小管，未見雜菌污染；菌落邊緣光滑，有特殊的光澤，呈顏色一致的灰白色半透明狀，培養(yǎng)基中未出現(xiàn)其他形態(tài)的菌落。

2.2 革蘭氏染色

革蘭氏染色DH5α/pUC57重組菌，5×n（n=0～6）代均為革蘭氏陰性（Gram negative bacillus，G-）短桿菌，形態(tài)無明顯差異，詳見圖1。

圖1 原代和30 代重組菌革蘭氏染色Fig. 1 Original and 30 generation recombinant bacteria gram staining

2.3 特定糖發(fā)酵

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代均接種乳糖生化管，培養(yǎng)基顏色為均一的紫色；接種葡萄糖生化管與甘露醇生化管，培養(yǎng)基顏色為均一的黃色；各組生化管內(nèi)均沒有觀察到氣體產(chǎn)生，生化特性一致。具體情況見圖2。

圖2 重組菌糖發(fā)酵試驗(yàn)Fig. 2 Sugar fermentation test of recombinant bacteria

2.4 質(zhì)粒丟失率

挑取100個(gè)5×n（n=0～6）代DH5α/pUC57重組菌的單個(gè)菌落，接種于含Amp＋的LB 固體培養(yǎng)皿上，37℃條件下無菌培養(yǎng)12 h均形成單菌落，經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒丟失率均為0。

2.5 分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 DH5α工程菌16S rDNA 鑒定

以5×n（n=0～6）代總DNA為模板，根據(jù)DH5α工程菌16S rDNA序列合成引物，5×n（n=0～6）代均擴(kuò)增出1.2 kb大小相似的片段（圖3）。使用5 000 bp DNA Marker作為參照，由圖3可知，5×n（n=1～6）代與原代擴(kuò)增得到的條帶大小一致，說明目的片段在傳代過程中未丟失。

圖3 DH5α工程菌16S rDNA PCR鑒定Fig. 3 16S rDNA PCR identification of DH5α

2.5.2 質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序

DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代的重組質(zhì)粒經(jīng)性能穩(wěn)定的限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切鑒定，882 bp和4.7 kb附近出現(xiàn)固定的條帶（圖4），且質(zhì)粒超螺旋比均大于90%。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig. 4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid

2.5.3 DH5α 16S rDNA 和ChIL-2-ChIL-4基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)DH5α/pUC57重組菌5×n（n=0～6）代16S rDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果采用NCBI網(wǎng)站中的BLAST在線工具與大腸桿菌進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，各代次重組菌與大腸桿菌同源性均大于95%，詳見表1。5×n（n=0～6）代重組質(zhì)粒中的目的片段與ChIL-2-ChIL-4基因序列100% 匹配。

表1 DH5α 16S rDNA 測(cè)序結(jié)果Tab. 1 DH5α 16S rDNA sequencing results

2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)效果

2.6.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

各代次重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞48 h時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率無顯著差異（P>0.05），詳見圖5。

圖5 各代次重組質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染率Fig. 5 Transfection rate of each generation of recombinant plasmid

2.6.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的融合蛋白表達(dá)效果

重組質(zhì)粒在ST細(xì)胞內(nèi)的ChIL-2-ChIL-4 蛋白表達(dá)量，在各代次之間無顯著性的差異（P>0.05），詳見圖6。

圖6 各代次蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Protein relative expression of each generation

2.7 表達(dá)分泌產(chǎn)物活性

各代次重組質(zhì)粒在ST細(xì)胞中分泌表達(dá)的ChIL-2-ChIL-4 融合蛋白均能極顯著地（P<0.001）促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞增殖，且其促進(jìn)雛雞脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖的能力無顯著差異（P>0.05），詳見圖7。

圖7 各代次蛋白刺激指數(shù)Fig. 7 SI of each generation of protein

3 討論

重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性是實(shí)驗(yàn)室高效表達(dá)生物活性物質(zhì)商業(yè)化的主要阻力和限制性因素［7-10］。能否有條件形成工業(yè)化生產(chǎn)能力，提供足量可靠的表達(dá)產(chǎn)物是確定其應(yīng)用規(guī)模的重要指標(biāo)。重組質(zhì)粒的存在對(duì)菌株的生長(zhǎng)常造成一定的壓力，導(dǎo)致其生長(zhǎng)特性可能發(fā)生變化。研究證實(shí)，培養(yǎng)體系加入一定的篩選壓力（如抗生素）可以顯著提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，避免雜菌的生長(zhǎng)［11-14］。

DH5α重組菌連續(xù)快速迭代的過程中，質(zhì)粒時(shí)常分裂延遲，造成重組菌丟失目的質(zhì)粒。因此，驗(yàn)證重組菌攜帶的質(zhì)粒的穩(wěn)定性是成功培養(yǎng)高質(zhì)量重組工程菌的關(guān)鍵。本研究結(jié)果與Zhou等［15］試驗(yàn)結(jié)果一致，0～30代重組菌菌落形態(tài)均勻一致，符合DH5α大腸桿菌的典型菌落特征，且染色鏡檢未發(fā)現(xiàn)雜菌污染。16S rDNA序列的同源性大于97%的細(xì)菌可認(rèn)為是同一種屬［16-17］。本研究中的重組菌其16S rDNA序列同源性為98%～99%，說明重組質(zhì)粒對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)無顯著的影響。質(zhì)粒丟失率為0，說明未出現(xiàn)分裂不穩(wěn)定性現(xiàn)象。研究表明，重組菌連續(xù)傳代30代仍能夠保證極高的菌株純粹性、不發(fā)生質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象，穩(wěn)定的目的片段遺傳穩(wěn)定性，且質(zhì)粒超螺旋比均大于90%，目的片段與ChIL-2-ChIL-4基因序列100%匹配。

白介素類疫苗佐劑商品化的過程需要保證重組質(zhì)粒的持久的遺傳穩(wěn)定性，這對(duì)于基因佐劑的臨床應(yīng)用及科學(xué)研究具有重要意義。本研究表明，攜帶ChIL-2-ChIL-4融合基因片段的DH5α/pUC57重組菌37℃?zhèn)鞔?30 次，重組質(zhì)?？杀３州^高的遺傳穩(wěn)定性，能夠在大規(guī)模生產(chǎn)過程中保持細(xì)胞因子產(chǎn)物的均一性，具有作為雞球蟲活疫苗免疫佐劑的商品化臨床應(yīng)用潛力。