高粱全基因組NRT1基因鑒定、表達(dá)與DNA變異分析

郭志強(qiáng)，梁月秀，馮 凡，朱立勛，范佳麗，姜曉東，呂晉慧，張春來(lái)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家功能雜糧技術(shù)創(chuàng)新中心，山西省旱作栽培與作物生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西省黃土高原特色作物高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，太谷 030801）

高粱（Sorghum bicolor）是世界上僅次于小麥、水稻、玉米和大麥的第五大糧食作物［1］，主要種植在干旱和半干旱地區(qū)，屬于短日照C4植物，具有抗旱、耐貧瘠和耐鹽堿等特性［2］，栽培面積較為廣泛。高粱基因組DNA測(cè)序工作初步在2009年完成，并于最近得到更新，這使得從基因組水平來(lái)揭示高粱重要基因家族的功能成為可能［3-4］。

植物氮利用率（nitrogen use efficiency，NUE）取決于植物的需求和植物對(duì)氮的吸收、運(yùn)輸、積累和再分配。氮素作為植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的必要元素之一，是植物體內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、葉綠素、核酸等的組成成分［5］。此外，氮素也是影響作物產(chǎn)量的因素之一［6］。氮供應(yīng)水平影響植物葉片顏色、大小以及葉片數(shù)，進(jìn)而影響植物對(duì)光的吸收能力，最終影響植物的生產(chǎn)力，特別是對(duì)于多葉蔬菜［6］。硝酸鹽（NO3-）是大多數(shù)植物中最重要的氮源。提高硝酸鹽吸收能力和植物氮利用率的重要步驟是識(shí)別負(fù)責(zé)硝酸鹽運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)輸者的特征，然后通過(guò)傳統(tǒng)的育種技術(shù)或基因工程操作來(lái)提高硝酸鹽吸收特性。近年來(lái)，對(duì)擬南芥、水稻等植物的營(yíng)養(yǎng)研究表明，植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的過(guò)程主要由4個(gè)蛋白家族成員介導(dǎo)完成，分別為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（nitrate transporter 1，NRT1）、硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（nitrate transporter 2，NRT2）、氯酸鹽通道家族（chloride channel，CLC）以及慢離子相關(guān)通道同系物（slow anion channel- as- sociated homolog，SLAC/SLAH）［7］。除此之外，還有許多蛋白酶、激素等參與，它們相互作用構(gòu)成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［8-10］。

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（nitrate transporter，NRT），又稱(chēng)為寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（peptide transport，PTR），在動(dòng)物、植物、酵母、古生菌以及細(xì)菌基因組中都有發(fā)現(xiàn)，是一種依賴(lài)于質(zhì)子、具有專(zhuān)一性、依賴(lài)能量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。蛋白的質(zhì)子依賴(lài)性PTR家族與ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette，ABC）不同，是通過(guò)對(duì)最近發(fā)現(xiàn)的一些肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行序列分析而發(fā)現(xiàn)的［11］。這些蛋白質(zhì)似乎主要參與小肽的攝取，同時(shí)還攝取質(zhì)子［12］。

一些NRT也執(zhí)行肽的運(yùn)輸，有的還運(yùn)輸抗生素，它們通過(guò)質(zhì)子共運(yùn)發(fā)揮作用，但底物對(duì)H+的化學(xué)計(jì)量學(xué)是可變的，如高親和力的大鼠PepT2載體分別催化中性和陰離子二肽攝取兩個(gè)和三個(gè) H+，而低親和力的PepT1載體催化每個(gè)中性肽攝取一個(gè)H+［13］。

本研究對(duì)SbNRT1的基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因表達(dá)、選擇進(jìn)化及其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，為NRT1基因調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因檢索

以水稻（Oryza sativa）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的NRT1氨基酸序列作為參考，在Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜尋和比對(duì)，獲得SbNRT1基因家族的基因序列、編碼序列（coding sequence，CDS）、氨基酸序列。小麥（Triticum aestivum）與甜菜（Betavulgaris）的NRT1蛋白質(zhì)序列來(lái)自NCBI；藜麥（Chenopodium quinoa Willd）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、谷子（Setaria italic）的NRT1蛋白質(zhì)序列來(lái)自Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)（http://plants. ensembl. org/index.html）。

1.2 生物信息學(xué)分析方法

采用Gene Structure Display Sever數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）［14］分析基因的結(jié)構(gòu) ；采用 Ex-PASY-ProtParam tool數(shù)據(jù)庫(kù)（http://web.expasy.org/protparam）對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用Sig-nalP-5.0 Server數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽；采用PSORT數(shù)據(jù)庫(kù)（psort1.hgc.jp/form.html）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析預(yù)測(cè)。

采用SOPMA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)（www.sbg.bio.ic.ac.uk/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的預(yù)測(cè)，采用Ramachandran Plot Analysis數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mordred.bioc.cam.ac.uk/）檢驗(yàn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

利用 MEGA 7［15］軟件對(duì)序列進(jìn)行 Clustal W［16］比對(duì)，然后再使用鄰接法（neighbour joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用已發(fā)表的SbNRT1基因表達(dá)Atalas數(shù)據(jù)［17-18］，在phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中獲取目的基因在高粱各個(gè)生育期、不同器官部位的表達(dá)量，再利用Heml軟件作出表達(dá)量的熱圖。利用MEGA 7軟件對(duì)CDS序列進(jìn)行比對(duì)，再利用TBtools軟件計(jì)算出基因的進(jìn)化選擇壓力。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbNRT1基因家族基本信息

利用Phytozome和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，結(jié)合高粱各組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，得到SbNRT1基因20個(gè)（表1）。SbNRT1基因長(zhǎng)度為1 762～12 364 bp，分布在第SBI-01、SBI-02、SBI-03、SBI-04、SBI-05、SBI-06、SBI-07、SBI-09、SBI-10共9條染色體上，每個(gè)SbNRT1基因都有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。本研究選用的為初級(jí)轉(zhuǎn)錄本蛋白，具體蛋白質(zhì)的編號(hào)如表1所示。

表1 SbNRT1基因家族基本信息Tab. 1 Basic information for the SbNRT1 gene family

2.2 SbNRT1基因結(jié)構(gòu)分析

SbNRT1基因結(jié)構(gòu)分析顯示：絕大多數(shù)SbNRT1均存在上下游非編碼區(qū)，但其長(zhǎng)度均比較短；CDS為編碼蛋白產(chǎn)物的序列，大部分基因CDS數(shù)量很少，在3～4個(gè)之間，小部分基因CDS數(shù)量在5～8個(gè)之間 ；其中Sobic.001G133900、Sobic.001G276600、Sobic.007G044300、Sobic.010G175900等基因的內(nèi)含子較長(zhǎng)，由于外顯子與內(nèi)含子接頭區(qū)存在一段高度保守的一致序列，這幾個(gè)基因相對(duì)其他SbNRT1存在更多的高度保守序列數(shù)量（圖1）。

圖1 SbNRT1基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 SbNRT1 gene structure

2.3 SbNRT1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

由表2可知：SbNRT1蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目在250～667個(gè)之間；分子量大小在26 334.30～72 337.95 Da之間；理論等電點(diǎn)在5.72～9.53之間，大部分SbNRT1蛋白質(zhì)等電點(diǎn)大于7；不穩(wěn)定系數(shù)分析表明，14個(gè)SbNRT1蛋白為穩(wěn)定蛋白，6個(gè)Sb-NRT1蛋白為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)>40）；脂溶系數(shù)的高低決定了蛋白質(zhì)的流動(dòng)性，系數(shù)越高，流動(dòng)性越好，除Sobic.009G049900蛋白外，其余19個(gè)SbNRT1蛋白的脂溶系數(shù)均大于90，表明SbNRT1蛋白的流動(dòng)性較好；親水性平均值都大于0，表明Sb-NRT1蛋白質(zhì)均為疏水性蛋白［19］。

表2 SbNRT1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab. 2 The physical properties of SbNRT1 proteins

2.4 SbNRT1蛋白質(zhì)信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)蛋白質(zhì)信號(hào)肽分布，Sobic.004G260500、Sobic.006G251200、Sobic.007G044300、Sobic.007G081300、Sobic.009G049900、Sobic.010G099700這6個(gè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽分值（signal peptide score，S）均>0.5，表明蛋白含信號(hào)肽，為分泌性蛋白；剩余的蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分值（cut score，C）、綜合剪切位點(diǎn)分值（synthetical cut score，Y）均<0.5，表明蛋白都不含信號(hào)肽，不是分泌性蛋白。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，有17個(gè)蛋白定位在質(zhì)膜上，概率區(qū)間為60%～82%，有3個(gè)蛋白定位在葉綠體類(lèi)囊體膜上，概率分別為94.8%、93.9%和66.4%（表3）。

表3 SbNRT1蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位Tab. 3 Subcellular location of SbNRT1 proteins

2.5 SbNRT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SbNRT1蛋白家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成（二者在蛋白質(zhì)中所占氨基酸數(shù)量的比例大于70%），而延伸鏈（β-折疊的組成結(jié)構(gòu)）、β-轉(zhuǎn)角比例較低（表4）。由此可以推測(cè)出，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是SbNRT1蛋白的大量結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布在整個(gè)蛋白質(zhì)中。

表4 SbNRT1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Tab. 4 Analysis of the secondary structure of SbNRT1 protein unit: %

2.6 SbNRT1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型

采用phyre 2軟件預(yù)測(cè)高粱NRT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，NRT1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖2）。采用Ramachandran plot analysis軟件評(píng)估建模模型，結(jié)果顯示，氨基酸殘基所處的最佳區(qū)域比例為63.00%～88.50%，可接受區(qū)域氨基酸殘基比率為8.90%～32.80%，SbNRT1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的可信度均大于93.00%（表5）。

表5 SbNRT1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型評(píng)估Tab. 5 Evaluation of tertiary structure model of SbNRT1 protein unit: %

圖2 SbNRT1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig. 2 Tertiary structure models of SbNRT1 proteins

2.7 SbNRT1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

SbNRT1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，Sb-NRT1基因進(jìn)化樹(shù)的變異值為0.1，高粱各基因間相互存在同源性，但大部分基因同源性不高。其中Sobic.001G302800與Sobic.004G193000，Sobic.003G185100與Sobic.007G044300，Sobic.001G133900與Sobic.009G148900等旁系同源序列的同源性較高（圖3）。對(duì)高粱、擬南芥、大豆、玉米和谷子的NRT1基因家族進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖4），不同顏色范圍代表不同亞族，結(jié)果表明：NRT1基因家族分為8類(lèi)，即8個(gè)亞族，Sobic.004G260500與Zm00001eb189000，Sobic.002G091800與Zm00001eb304390，Sobic.010G099700與Zm00001eb371840、KQL10112，Sobic.003G399200與KQL15490、Zm00001eb025860，Sobic.003G107100與Zm00001eb126980互為直系同源基因，說(shuō)明高粱與谷子、玉米的NRT1基因在進(jìn)化過(guò)程中同源關(guān)系更近；進(jìn)化樹(shù)中的雙子葉植物（大豆、擬南芥）與單子葉植物（高粱、玉米和谷子）大多不能聚集在同一分支下，說(shuō)明NRT1基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)單雙子葉的分化。

圖3 SbNRT1基因家族聚類(lèi)圖Fig. 3 Clustering of SbNRT1 gene family

圖4 高粱、玉米、擬南芥、大豆、谷子的NRT1基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of NRT1 gene family in Sorghum bicolor, Zea mays L., Arabidopsis, Glycine max (Linn.) Merr, Setaria italica

2.8 SbNRT1基因表達(dá)

利用高粱表達(dá)Atalas數(shù)據(jù)構(gòu)建表達(dá)量熱圖（圖5），可知SbNRT1基因的表達(dá)具有時(shí)空專(zhuān)一性。Sobic.010G175900、Sobic.010G099700、Sobic.009G148900、Sobic.009G049900、Sobic.007G160900等基因在整個(gè)高粱生育期表達(dá)很低；Sobic.003G295500在整個(gè)生育期表達(dá)水平較低 ；但是Sobic.001G133900、Sobic.004G193000、Sobic.001G302800在生育期某個(gè)階段表達(dá)水平比較高，其中，Sobic.004G193000在生育期多個(gè)部位表達(dá)水平較高，尤其在左下生長(zhǎng)花期表達(dá)水平最高，Sobic.001G302800在左葉、葉鞘生長(zhǎng)花部位表達(dá)水平較高。從SbNRT1基因整個(gè)表達(dá)時(shí)期可以看出，表達(dá)水平由高到低依次為左下生長(zhǎng)花期、葉片、莖中部節(jié)間、根部。

圖5 SbNRT1基因家族表達(dá)熱圖Fig. 5 Heat map for expression of SbNRT1 gene family

在高粱根部Sobic.001G133900的表達(dá)受銨鹽和尿素誘導(dǎo)，受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)的為Sobic.001G133900、Sobic.003G295500和Sobic.001G302800，而Sobic.003G295500似乎僅在硝酸鹽誘導(dǎo)下表達(dá)。

2.9 SbNRT1進(jìn)化選擇分析

在遺傳學(xué)中用非同義突變率（non-synonymous mutation rate，ka）與同義突變率（synonymous mutation rate，ks）的比值作為這個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因是否有選擇壓力作用的標(biāo)準(zhǔn)。如果ka/ks遠(yuǎn)大于1，則存在正選擇效應(yīng)；如果ka/ks=1,則認(rèn)為存在中性選擇；如果ka/ks遠(yuǎn)小于1，則存在純化選擇作用。通過(guò)對(duì)Sb-NRT1同源蛋白基因?qū)Φ倪M(jìn)化選擇壓力分析，得出SbNRT1蛋白編碼區(qū)基因的ka/ks遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明SbNRT1蛋白質(zhì)編碼基因存在純化選擇作用（表6）。

表6 SbNRT1進(jìn)化選擇參數(shù)Tab. 6 SbNRT1 evolutionary selection parameters

3 討論

高粱抗旱性和耐鹽性強(qiáng)，在貧瘠土壤上種植也能有一定的收成，是典型的“環(huán)境友好型”作物，是研究作物抗逆性的模式植物之一。由于高粱抗逆境能力比其他作物更強(qiáng)，所以越來(lái)越多的植物科學(xué)家將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了高粱上，而其中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的挖掘更是成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前Sb-NRT1基因的鑒定和系統(tǒng)分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從全基因組水平上對(duì)SbNRT1基因家族進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了表達(dá)分析和DNA選擇分析，為研究其功能、建立分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明：高粱全基因組內(nèi)鑒定出SbNRT1基因共有20個(gè)，分布在SBI-01、SBI-02、SBI-03、SBI-04、SBI-05、SBI-06、SBI-07、SBI-09、SBI-10共9條染色體上；SbNRT1蛋白質(zhì)均為疏水性蛋白，且理論等電點(diǎn)大于7；6個(gè)SbNRT1蛋白為不穩(wěn)定蛋白，14個(gè)SbNRT1蛋白為穩(wěn)定蛋白；75%以上的SbNRT1蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽，不是分泌性蛋白，這與大多數(shù)SbNRT1蛋白亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜上的結(jié)果表現(xiàn)一致；SbNRT1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲；SbNRT1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，但模型可信度均大于93%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，SbNRT1蛋白家族分為8個(gè)亞家族，高粱與玉米、谷子的NRT1蛋白質(zhì)在進(jìn)化上同源關(guān)系更近。此結(jié)果與葉玲等［20］對(duì)谷子NRT2基因家族生物信息分析結(jié)果一致。從表達(dá)熱圖上可以分析得出，SbNRT1基因表達(dá)具有較強(qiáng)的器官、生育期特異性，尤其以Sobic.004G193000基因表達(dá)水平較高。在高粱根部受硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)最強(qiáng)的基因?yàn)镾obic.001G133900、Sobic.003G295500和Sobic.001G302800，前者也受銨鹽和尿素誘導(dǎo)，而Sobic.003G295500似乎僅在硝酸鹽誘導(dǎo)下表達(dá)。以上結(jié)果為研究基因功能及氮肥響應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)。

對(duì)SbNRT1基因的表達(dá)進(jìn)行分析有助于進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因，為高粱相關(guān)基因的進(jìn)一步鑒定與功能研究奠定理論基礎(chǔ)，為后續(xù)分子育種提供思路，也為揭示該基因家族參與植物氮素吸收利用的調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。