沈雅麗 潘陽(yáng)陽(yáng) 王靖雷 馬睿 趙改紅 王桂榮 張倩 王萌

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

在藥物開(kāi)發(fā)早期階段，篩選藥物用于靶標(biāo)驗(yàn)證和ADMET（吸收absorption，分布distribution，代謝metabolism，消除elimination和毒性toxicity）分析非常重要［1-2］，目前已有篩選方法評(píng)估小分子藥物藥理特性和調(diào)控機(jī)制，如動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)、高通量LCMS-MS方法等［3］，但由于成本高、試驗(yàn)周期長(zhǎng)，這些方法僅提供有限用途。因此尋求一種快速、高效的藥物篩選方法已成為近年來(lái)的研究焦點(diǎn)之一。孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是核受體家族的重要成員之一，由NR1I2基因編碼，是機(jī)體解毒的重要核轉(zhuǎn)錄因子。PXR在藥物代謝方面和藥物相互作用方面具有重要作用，臨床上約50%藥物通過(guò)激活PXR介導(dǎo)的CYP3A4酶進(jìn)行代謝［4］，并且還發(fā)現(xiàn)其參與更多的生理、病理過(guò)程，如維持機(jī)體細(xì)胞增殖分化、生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、穩(wěn)態(tài)維持和多種代謝性疾病、炎癥、癌癥等［5-6］。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道有關(guān)PXR和（或）其配體如何誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)重要生理過(guò)程的研究［7-8］。PXR活化后影響藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)與代謝，如細(xì)胞色素酶P450（cytochrome P450，CYP450）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases，GSTs）、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronyl transferases，UGTs）、多藥耐藥蛋白（multidrug resistance proteins，MDRs）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽酶（organic anion transport peptidases，OATPs）等［9-10］。因此，尋找PXR的新誘導(dǎo)劑，不僅可以對(duì)研究CYPs的誘導(dǎo)及相應(yīng)藥物-藥物相互作用和藥物研發(fā)提供指導(dǎo)，對(duì)于疾病的治療也具有極大意義。報(bào)告基因技術(shù)在基于細(xì)胞檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)中發(fā)揮了重要作用［11］。本實(shí)驗(yàn)旨在建立pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因藥物篩選方法，并考察恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然產(chǎn)物激活mPXR的誘導(dǎo)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株與質(zhì)粒 昆明小白鼠（20± 5 g）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（甘）2015-0001）。動(dòng)物購(gòu)進(jìn)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，小鼠飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃、濕度50%±5%、12 h明暗循環(huán)全價(jià)配合飼料以及純凈水供小鼠自由攝取。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序與福利均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：GSAUAEW20200911）。Hepa 1-6小鼠肝癌細(xì)胞購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；質(zhì)粒pGL3-basic、pRL-TK購(gòu)自Promega公司。

1.1.2 主要試劑及藥品 RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit非連接酶依賴(lài)型單片段快速克隆試劑盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2 000 Plus DNA Marker和DL 15 000 DNA Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；GoTaq Green Master Mix 2×、Dual-Luciferase?Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司；限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、Hind Ⅲ均購(gòu)自TaKaRa公司；通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌Escherichia coli DH5α均購(gòu)自天根生化科技有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；地塞米松、恩諾沙星、氟苯尼考、金絲桃苷、熊果酸、秦皮乙素、柚皮素、甘草次酸和莽草酸購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素和牛蒡子苷購(gòu)自南京源植科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組RNA提取 取小鼠新鮮肝組織，按Omega RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用作PCR模板，-20℃保存，備用。

1.2.2 目的片段引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)同源重組引物設(shè)計(jì)原則和小鼠PXR基因啟動(dòng)子序列（選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb），采用同源重組法設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。上游引物加入Xho I酶切位點(diǎn)（CTCGAG），下游引物加入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)（AAGCTT）；引物由上海生工生物工程有限公司合成，PXR啟動(dòng)子擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2 042 bp。構(gòu)建流程圖如圖1所示。

圖1 pGL3-basic-PXRpro重組質(zhì)粒構(gòu)建流程Fig.1 Construction process of pGL3-basic-PXRpro recombinant plasmid

表1 引物序列表Table 1 List of primer sequence used in PCR

1.2.3 目的片段擴(kuò)增 以1.2.1中反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為PCR模板，擴(kuò)增PXR啟動(dòng)子DNA序列。擴(kuò)增體系為：GoTaq Green Master Mix 2× 10 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、RNase-free ddH2O 8 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸125 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中，在180 V電壓下電泳30 min，254 nm紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.4 pGL3-basic-PXRpro構(gòu)建及鑒定 從瓊脂糖凝膠中切出需回收的目的條帶，電泳條帶用通用型DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。將PCR純化產(chǎn)物與pGL3-basic分別進(jìn)行雙酶切。將雙酶切后的DNA片段和線性化pGL3-basic載體用ClonExpress?II One Step Cloning Kit試劑盒進(jìn)行連接，重組反應(yīng)體系（20 μL）見(jiàn)表2。體系置于PCR儀中37℃，反應(yīng)30 min降至4℃，或立即置于冰上冷卻。連接的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)皿培養(yǎng)12-16 h，挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化板上陽(yáng)性克隆菌落，用F和R引物進(jìn)行菌落PCR以鑒定目的片段是否轉(zhuǎn)入。將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆菌落提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建成功后重組載體命名為pGL3-basic-PXRpro。

表2 重組反應(yīng)體系Table 2 Recombination reaction system

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Hepa 1-6小鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM/F-12），另加10%胎牛血清、1%青/鏈霉素、1%丙酮酸鈉，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳。設(shè)空白組（只鋪細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染）、空載組（0.2 μg pGL3-basic + 0.01 μg pRL-TK）、攜帶報(bào)告基因載體的對(duì)照組（0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）、小鼠PXR的陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組（地塞米松 + 0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK）。轉(zhuǎn)染前，將Hepa 1-6細(xì)胞以2×104/孔接種于96孔板培養(yǎng)，待生長(zhǎng)融合度達(dá)70%-80%；在轉(zhuǎn)染前1 h，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，PXR的陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組加入含地塞米松（10 μmol/L）的培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染時(shí)，將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至相應(yīng)孔內(nèi)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒提供的方案操作。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測(cè)細(xì)胞 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理24 h后，用預(yù)冷的PBS溶液潤(rùn)洗3次，盡量吸凈孔內(nèi)的液體，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明，用GLOMAX 20/20發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶活性測(cè)定。主要操作步驟：用ddH2O將5×Passive lysis buffer 5倍比稀釋?zhuān)悦靠?0 μL體積加入到96孔板中，于水平搖床室溫輕緩晃動(dòng)15 min，至細(xì)胞裂解完全。取上述各孔細(xì)胞裂解液10 μL于1.5 mL EP管中，加50 μL LAR II，快速測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。再加50 μL Stop＆GLO試劑，測(cè)定海腎熒光素酶活性。記錄螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。

1.2.7 恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然產(chǎn)物對(duì)PXR啟動(dòng)子的誘導(dǎo)作用 應(yīng)用pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因法檢測(cè)恩諾沙星、氟苯尼考及連翹中10種天然產(chǎn)物對(duì)mPXR的激活作用。采用等差法進(jìn)行藥物稀釋?zhuān)幬餄舛葹?、20、40、60、80、100 μmol/L。以10 μmol/L的地塞米松作為陽(yáng)性對(duì)照，將0.2 μg pGL3-basic-PXRpro + 0.01 μg pRL-TK共 轉(zhuǎn)染每孔細(xì)胞。按照1.2.5中的步驟處理細(xì)胞，24 h后根據(jù)1.2.6的方法測(cè)定雙熒光素酶活性。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism軟件對(duì)各組熒光素酶活性的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行組間單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PXR啟動(dòng)子區(qū)域擴(kuò)增

以1.2.1中反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板擴(kuò)增PXR啟動(dòng)子區(qū)域序列，得到長(zhǎng)度為2 042 bp的片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，PXR啟動(dòng)子擴(kuò)增片段大約為2 000 bp。

圖2 PCR擴(kuò)增PXR啟動(dòng)子片段凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplified PXR promoterfragment

2.2 重組質(zhì)粒的篩選及菌落PCR

將PXR啟動(dòng)子片段條帶進(jìn)行純化回收，將PXR啟動(dòng)子片段和pGL3-basic載體雙酶切（Xho I和Hind Ⅲ）后進(jìn)行重組反應(yīng)，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布含氨芐抗性的LB培養(yǎng)皿，過(guò)夜培養(yǎng)，重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化板上形成數(shù)百個(gè)單克隆菌落，陰性對(duì)照反應(yīng)轉(zhuǎn)化板上的克隆菌落數(shù)顯著少于前者，結(jié)果如圖3所示。在重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化板上挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果如圖4所示，第2泳道中擴(kuò)增條帶大小約為2 000 bp。說(shuō)明重組質(zhì)粒中含有PXR啟動(dòng)子片段。

圖3 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Fig.3 Recombinant product transformation

圖4 菌落PCR凝膠電泳Fig.4 Colony PCR gel electrophoresis

2.3 重組質(zhì)粒的雙酶切及測(cè)序鑒定

將初步篩選的陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行搖菌、小提質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切，結(jié)果如圖5所示，重組質(zhì)粒在相應(yīng)片段大小的位置切出載體片段和目的DNA片段，釋放2 042 bp大小的片段。測(cè)序結(jié)果（圖6）可知，由于測(cè)序時(shí)雜質(zhì)干擾的原因，兩端大約50 bp干擾較大，有1-2 bp突變，其余與原序列完全一致，證實(shí)重組質(zhì)粒包含PXR啟動(dòng)子序列且插入方向正確。以上結(jié)果表明包含PXR啟動(dòng)子序列的報(bào)告基因載體pGL3-basic-PXRpro構(gòu)建成功。

圖5 pGL3-basic-PXRpro雙酶切鑒定電泳Fig.5 Gel electrophoresis of pGL3-basic-PXRpro by double restriction enzymes digestion

圖6 pGL3-basic-PXRpro的部分測(cè)序結(jié)果Fig.6 Partial sequencing results of pGL3-basic-PXRpro

2.4 地塞米松對(duì)pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的驗(yàn)證

用mPXR的經(jīng)典誘導(dǎo)劑地塞米松（10 μmol/L）來(lái)驗(yàn)證pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的可行性和有效性。由圖7可以看出，攜帶報(bào)告基因載體的對(duì)照組（圖7-C）相對(duì)熒光素酶活性顯著高于空載組（圖7-B）（P＜0.05），小鼠PXR陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組（圖7-D）相對(duì)熒光素酶活性顯著高于攜帶報(bào)告基因載體的對(duì)照組（P＜0.05）。由表3可以看出，經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每個(gè)樣品的相對(duì)熒光素酶活性表達(dá)穩(wěn)定，小鼠PXR陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組的相對(duì)熒光素酶活性之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果證明，pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的可行性和有效性。

表3 地塞米松3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)熒光素酶活性Table 3 Relative luciferase activity of dexamethasone in three independent repeated experiments

圖7 PXR啟動(dòng)子報(bào)告基因藥物篩選方法構(gòu)建的驗(yàn)證Fig.7 Validation of constructed PXR promoter reporter gene drug screening method

2.5 兩種抗菌藥對(duì)pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響

應(yīng)用已成功構(gòu)建的報(bào)告基因藥物篩選方法檢測(cè)恩諾沙星、氟苯尼考對(duì)mPXR啟動(dòng)子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 轉(zhuǎn) 染 的Hepa 1-6細(xì)胞經(jīng)地塞米松（10 μmol/L）及恩諾沙星、氟苯尼考孵育24 h后，根據(jù)1.2.6方法檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。如圖8所示，恩諾沙星、氟苯尼考在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子均有激活作用。

圖8 兩種抗菌藥作用Hepa 1-6細(xì)胞后的相對(duì)熒光素酶活性Fig.8 Relative luciferase activity of two antibacterial drugs after treated in Hepa 1-6 cells

2.6 基于小鼠pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因法對(duì)10種連翹天然產(chǎn)物的篩選

應(yīng)用已成功構(gòu)建的報(bào)告基因藥物篩選方法檢測(cè)10種連翹天然產(chǎn)物對(duì)mPXR啟動(dòng)子的激活作用。0.2 μg pGL3-basic-PXRpro和0.01 μg pRL-TK 共 轉(zhuǎn) 染 的Hepa 1-6細(xì)胞經(jīng)地塞米松（10 μmol/L）及10種天然產(chǎn)物孵育24 h后，根據(jù)1.2.6方法檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。如圖9所示，金絲桃苷在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子均有激活作用，20-60 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子是激活作用，但在80-100 μmol/L激活作用逐漸降低；熊果酸在20-100 μmol/L均可激活PXR啟動(dòng)子；秦皮乙素對(duì)PXR啟動(dòng)子的激活作用最弱，在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子的激活作用變化不大；柚皮素在20-60 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子具有激活作用且呈劑量依賴(lài)性，但在80-100 μmol/L無(wú)PXR啟動(dòng)子活性；甘草次酸在20-60 μmol/L濃度下可以激活PXR啟動(dòng)子無(wú)劑量依賴(lài)，在80-100 μmol/L則對(duì)PXR 啟動(dòng)子無(wú)激活作用；莽草酸在20-40 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子無(wú)激活作用，但在60-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子有激活作用；連翹酯苷A在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子激活作用最為明顯；連翹苷在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子均有激活作用，但在100 μmol/L時(shí)相對(duì)活性降低，20-80 μmol/L呈劑量依賴(lài)；連翹脂素在20-100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子均為誘導(dǎo)作用并呈劑量依賴(lài)；牛蒡子苷對(duì)PXR啟動(dòng)子激活作用較高，在20-60 μmol/L呈劑量依賴(lài)，80 μmol/L激活作用下降，在100 μmol/L對(duì)PXR啟動(dòng)子無(wú)激活作用。9種天然產(chǎn)物對(duì)PXR啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性有一定的誘導(dǎo)作用，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖9 10種連翹天然產(chǎn)物作用Hepa 1-6細(xì)胞后的相對(duì)熒光素酶活性Fig.9 Relative luciferase activity of 10 kinds of Forsythia suspensa natural products treated on Hepa 1-6 cells

3 討論

我國(guó)中草藥資源豐富，目前已有較多報(bào)道表明中藥提取物和天然產(chǎn)物可激活PXR起到治療疾病的作用［12-13］。闡明PXR在生理或病理過(guò)程中的作用既是在藥理學(xué)的重大挑戰(zhàn)，又是確定新的藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)的潛在機(jī)會(huì)［14］。因此構(gòu)建一種基于mPXR啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因的藥物篩選方法具有重要意義。如何快速、高效的篩選PXR誘導(dǎo)劑，不僅有助于研究PXR誘導(dǎo)的CYPs藥物-藥物相互作用，還可以為藥物研發(fā)和臨床用藥安全提供一定的理論指導(dǎo)。

地塞米松是小鼠PXR公認(rèn)的經(jīng)典誘導(dǎo)劑［15］，通過(guò)地塞米松來(lái)驗(yàn)證pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因藥物篩選方法/模型的可行性和有效性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，攜帶報(bào)告基因載體的對(duì)照組較空載組差異顯著，表明構(gòu)建的小鼠pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因具有啟動(dòng)子活性，其相對(duì)活性為0.112 9；小鼠PXR陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組較攜帶報(bào)告基因載體的對(duì)照組差異顯著，說(shuō)明地塞米松能顯著誘導(dǎo)PXR的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果證明基于小鼠pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因的藥物篩選方法構(gòu)建成功，作為藥物篩選工具是可行的。由表3可以看出，經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每個(gè)樣品的相對(duì)熒光素酶活性表達(dá)穩(wěn)定，小鼠PXR陽(yáng)性誘導(dǎo)劑地塞米松組的相對(duì)熒光素酶活性之間無(wú)顯著差異。進(jìn)一步證實(shí)了pGL3-basic-PXRpro作為藥物篩選工具的有效性?？傊琾GL3-basic-PXRpro報(bào)告基因藥物篩選方法可用于篩選誘導(dǎo)PXR的藥物單體及天然產(chǎn)物。

抗菌藥物可刺激肝臟解毒的I相酶［16］，也可誘發(fā)藥物性肝損傷［17］，PXR是肝臟藥物清除系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，在藥物性肝損傷起關(guān)鍵作用［18］。恩諾沙星和氟苯尼考是新一代常見(jiàn)的動(dòng)物專(zhuān)用抗菌藥，均能通過(guò)影響肝臟CYP450酶對(duì)肝臟造成損傷［19-21］。將構(gòu)建成功的報(bào)告基因藥物篩選方法用于考察恩諾沙星和氟苯尼考對(duì)PXR啟動(dòng)子的誘導(dǎo)效應(yīng)。劉婉玉等［22］通過(guò)代謝抑制實(shí)驗(yàn)得出，恩諾沙星在鯽魚(yú)肝微粒體代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶是CYP3A4。本試驗(yàn)結(jié)果表明，20-100 μmol/L恩諾沙星能顯著誘導(dǎo)PXR的表達(dá)。由此推斷恩諾沙星可能是通過(guò)PXR介導(dǎo)的CYP3A4酶進(jìn)行代謝。有研究表明，氟苯尼考對(duì)家兔肝臟CYP3A的基因表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，但家兔肝臟中CYP3A的誘導(dǎo)是否由PXR介導(dǎo)有待進(jìn)一步研究［23］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，20-100 μmol/L氟苯尼考能顯著誘導(dǎo)PXR的表達(dá)，但氟苯尼考是否通過(guò)誘導(dǎo)PXR介導(dǎo)的CYP3A酶進(jìn)行代謝，有待進(jìn)一步研究。由于種屬之間存在差異，恩諾沙星、氟苯尼考對(duì)PXR靶基因的作用還需進(jìn)一步研究。

近幾年連翹用量逐年增長(zhǎng)，作為常用大宗藥材之一，連翹具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、保肝等藥理作用，具有很好的開(kāi)發(fā)前景和藥用價(jià)值［24］。本試驗(yàn)采用報(bào)告基因藥物篩選法對(duì)連翹的10種天然產(chǎn)物進(jìn)行了篩選。有研究表明配體激活的PXR通過(guò)抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）在肝臟中的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［25-26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明100 μmol/L連翹脂苷A、20-80 μmol/L金絲桃苷和20-60 μmol/L牛蒡子苷均能顯著誘導(dǎo)PXR的表達(dá)，與陳麗青［27］、Pan等［28］、Kim等［29］、Lee等［30］的研究結(jié)果一致，表明通過(guò)pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因藥物篩選方法篩選的3種天然產(chǎn)物對(duì)PXR具有誘導(dǎo)作用，提示3種天然產(chǎn)物可能具有作為PXR介導(dǎo)抗炎候選藥物的潛力，對(duì)臨床用藥具有參考價(jià)值。PXR的激活使肝臟中藥物代謝速率加快并誘導(dǎo)多藥耐藥蛋白（MDR）表達(dá)，大多數(shù)藥物抗性酶的產(chǎn)生由PXR靶基因編碼，因此在癌癥化療過(guò)程中更易發(fā)生多藥耐藥［31］。有研究發(fā)現(xiàn)連翹提取物具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用［32-34］，本試驗(yàn)結(jié)果表明熊果酸、柚皮素、莽草酸、牛蒡子苷等均對(duì)PXR有誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步研究連翹提取物與PXR之間的關(guān)聯(lián)，可為治療癌癥藥物的研究開(kāi)發(fā)提供新方向。另外，有研究報(bào)道，熊果酸能夠通過(guò)激活PXR的表達(dá)抵抗四氯化碳導(dǎo)致的急性肝損傷和肝臟纖維化損傷［35-36］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，20-100 μmol/L熊果酸能顯著誘導(dǎo)PXR的表達(dá)，提示熊果酸可能具有作為PXR介導(dǎo)抗急性肝損傷、抗肝臟纖維化損傷候選藥物的潛力。樊威洋等發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L柚皮素能顯著下調(diào)HepaRG細(xì)胞PXR的蛋白表達(dá)，柚皮素可以發(fā)揮抗肝癌和肝損傷的作用［37-38］，為肝病治療提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，20-60 μmol/L柚皮素對(duì)PXR起激活作用，80-100 μmol/L起抑制作用，提示柚皮素發(fā)揮抗癌和抗肝損傷作用的最佳用量可能在80-100 μmol/L之間。He等［39］研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散中的生物活性成分甘草次酸有提高細(xì)胞核受體PXR蛋白表達(dá)量的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著差異，甘草次酸可激活PXR來(lái)增強(qiáng)CYP3A4的表達(dá)，從而起到治療抑郁癥的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，20-60 μmol/L甘草次酸能顯著誘導(dǎo)PXR的表達(dá)，說(shuō)明了甘草次酸可激活PXR，但沒(méi)有顯著差異，He等同樣佐證了本試驗(yàn)中甘草次酸對(duì)PXR的誘導(dǎo)作用。Rasmussen等［40］在研究菊苣次生代謝物對(duì)原代豬肝細(xì)胞CYP mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)，菊苣次生代謝物秦皮乙素對(duì)CYP3A沒(méi)有誘導(dǎo)作用，而對(duì)CYP1A2具有誘導(dǎo)作用，秦皮乙素可能是激活了AhR。由于種屬之間存在差異，秦皮乙素對(duì)CYPs的作用有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度秦皮乙素對(duì)PXR啟動(dòng)子的激活作用變化無(wú)顯著差異，提示秦皮乙素可能不是PXR配體。

綜上所述，采用本試驗(yàn)構(gòu)建的pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因藥物篩選方法可以快速、便捷地篩選出PXR的誘導(dǎo)劑。本試驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明了恩諾沙星、氟苯尼考以及10種連翹天然藥物對(duì)PXR轉(zhuǎn)錄水平的干預(yù)，報(bào)告基因藥物篩選方法為有效篩選PXR介導(dǎo)的肝損傷和藥物研發(fā)提供工具，同時(shí)為PXR為靶點(diǎn)的疾病防治提供候選藥物。報(bào)告基因藥物篩選方法作為體外PXR誘導(dǎo)劑的初篩手段，體內(nèi)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了小鼠pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因載體，建立了pGL3-basic-PXRpro報(bào)告基因的藥物篩選方法，并成功篩選出了PXR的誘導(dǎo)劑。報(bào)告基因藥物篩選法具有快速高效且操作周期短的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究PXR介導(dǎo)的肝損傷機(jī)制和藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。