聶甲玥 楊文文 樊紅霞 王幼平 吳德偉

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

在自然界中，病原菌侵染、昆蟲啃食、機(jī)械損傷等各種不利環(huán)境因素時(shí)刻威脅著植物的生存，而植物往往能夠利用一些外源或內(nèi)源信號分子，識別并有效應(yīng)對這些生物或非生物脅迫［1-3］。這些信號分子包括來源于病原菌的病原菌相關(guān)分子模式PAMP（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）［4-5］和來源于植物自身的損傷相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMP）［4］。PAMP和DAMP可以被定位于質(zhì)膜的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別［6］，進(jìn)而觸發(fā)植物抗性反應(yīng)。近年來，在植物中發(fā)現(xiàn)一類新型短肽Pep，可以作為一種DAMP分子，調(diào)控植物免疫。Pep在大多數(shù)被子植物中廣泛存在，包括一些重要的農(nóng)作物中，如玉米、水稻、番茄等［7-9］。一些研究表明，Pep可以正調(diào)控植物對細(xì)菌、真菌以及食草動物等的抗性［7，10-13］。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，Pep在植物生長發(fā)育［14-15］和非生物脅迫響應(yīng)［16-17］中也發(fā)揮重要的調(diào)控功能。本文將對近年來Pep相關(guān)的一些研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對該領(lǐng)域尚待解決的一些科學(xué)問題和可能的應(yīng)用方向進(jìn)行展望，以期對相關(guān)研究者有所啟發(fā)。

1 Pep的產(chǎn)生

2006年，Huffaker等［18］首先在擬南芥中鑒定到一種能激活植物先天免疫的、由23個(gè)氨基酸組成的植物內(nèi)源性短肽，并將其命名為AtPep1，拉開了Pep短肽研究的序幕。AtPep1由其前體蛋白AtPROPEP1切割而形成，而AtPROPEP1在擬南芥中有8個(gè)同源蛋白［19］（圖1），經(jīng)切割后分別形成AtPep1-AtPep8。前體蛋白AtPROPEPs的氨基酸序列整體上只有12%-47%相似性［20］，但其C端大多都含有一段相對保守的AtPep基序SSG-x2-G-x2-N（圖2）。

圖1 擬南芥中Pep前體蛋白PRPPEP1-PROPEP8氨基酸序列的保守性分析Fig.1 Amino acid sequence conservation analysis of Pep precursor proteins PROPEP1-PROPEP8 from Arabidopsis thaliana

圖2 擬南芥中Pep1-Pep8氨基酸序列的保守性分析Fig.2 Amino acid sequence conservation analysis of Pep1-Pep8 from Arabidopsis thaliana

除擬南芥外，PROPEP的同源基因也廣泛存在于其他被子植物中［8］。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，PROPEP形成植物種屬特異性的家族集群，但也有一些PROPEP的聚類與其植物種屬特征有所出入。例如，擬南芥編碼的PROPEP大多與十字花科植物的PROPEP分布在一起，但AtPROPEP6卻與茄科的PROPEP聚類在一起［8］。

擬南芥8個(gè)AtPROPEP基因在不同組織中的表達(dá)模式大致可分為兩類：AtPROPEP1/2/3/5/8主要在根中表達(dá)，在葉脈管系統(tǒng)中少量表達(dá)；而AtPROPEP4和AtPROPEP7僅在根尖中表達(dá)［19］。正常條件下，AtPROPEP基因的啟動子幾乎是不活躍的［21］，但植物在受到外界刺激時(shí)，這些前體蛋白編碼基因會被顯著誘導(dǎo)。例如，損傷可以誘導(dǎo)AtPROPEPR1/2/3/5/8的 表 達(dá)；flg22、MeJA（methy jasmonate）和NaCl誘 導(dǎo) 能 夠 誘 導(dǎo)AtPROPEP1和AtPROPEP3的表達(dá)。此外，AtPep1也可以誘導(dǎo)AtPROPEP1和AtPROPEP3的表達(dá)［22］，說明Pep信號途徑可能存在一定的正反饋調(diào)節(jié)。除了組織表達(dá)特異性之外，不同的AtPROPEP蛋白的亞細(xì)胞定位也存在一定差異，例如AtPROPEP1和AtPROPEP6定位于液泡膜上，而AtPROPEPR3定位在胞漿中［19］。

植物細(xì)胞中Pep如何由其前體蛋白加工而來，目前還不是十分清楚?，F(xiàn)有的研究提示，植物損傷后胞內(nèi)鈣離子濃度上升，激活相關(guān)蛋白酶，導(dǎo)致前體蛋白被蛋白酶切割，從而釋放成熟短肽。在擬南芥中，當(dāng)幼苗受到機(jī)械損傷后，產(chǎn)生的AtPep1可以在30 s內(nèi)被檢測到，并在5 min內(nèi)達(dá)到峰值，說明損傷誘導(dǎo)的Pep的產(chǎn)生是十分迅速的。蛋白酶抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)表明，前體蛋白的切割可能是由半胱氨酸蛋白酶Metacaspase介導(dǎo)的［23］。在擬南芥中，Metacaspase蛋白家族包括9個(gè)成員，根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同可分為兩種類型：Ⅰ型Metacaspase包括MC1-MC3，它們同時(shí)含有N端的pro-domain和C端的caspase-like domain，其中MC1與MC2可以相互拮抗的調(diào)控細(xì)胞程序性死亡［24］；Ⅱ型Metacaspase包括MC4-MC9，它們含有caspase-like domain，但缺失pro-domain。在擬南芥原生質(zhì)體中共表達(dá)Ⅱ型Metacaspase（MC4-MC9）能夠促進(jìn)PROPEP1的切割，說明Ⅱ型Metacaspase在由Pep的成熟過程中發(fā)揮重要作用［25］。Ⅱ型Metacaspase能夠在精氨酸殘基和賴氨酸殘基后切割底物蛋白，其蛋白酶活性大多數(shù)依賴于適當(dāng)?shù)腃a2+濃度［26］。當(dāng)植物處于靜息狀態(tài)時(shí)，胞質(zhì)中的Ca2+濃度較低，半胱氨酸蛋白酶MC4處于無活性或低活性狀態(tài)；而當(dāng)植物受到損傷后，胞質(zhì)中的Ca2+濃度上升，MC4被激活，從而切割PROPEP形成成熟短肽Pep［23］。

2 Pep的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.1 Pep的識別

在植物中，質(zhì)膜定位的模式識別受體PRR負(fù)責(zé)識別感知DAMP和PAMP，觸發(fā)植物免疫。PRRs由許多類受體激酶（receptor-like kinase，RLK）和類受體蛋白（receptor-like proteins，RLP）組成［6］。

2006年，Yamaguchi等［20］鑒 定 到AtPep1的受體AtPEPR1。AtPEPR1是一個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶（LRR-RLK）。2010年，Yamaguchi等［13］進(jìn)一步鑒定到AtPep的另一個(gè)受體AtPEPR2。AtPEPR2也屬于LRR-RLK，與AtPEPR1共同介導(dǎo)擬南芥對Pep的感知。AtPEPR1和AtPEPR2的組織表達(dá)模式相似，均主要在根（除了根尖）中表達(dá)，同時(shí)在其他組織中也有較低水平的表達(dá)［19，27］。AtPEPR1和AtPEPR2的 表 達(dá) 受 損 傷、MeJA和 多種PAMP分子的誘導(dǎo)，同時(shí)也可受Pep誘導(dǎo)，但不同的Pep對這2個(gè)受體基因的誘導(dǎo)強(qiáng)度不同。例如AtPep1-AtPep3是PEPR1的強(qiáng)誘導(dǎo)子，而AtPep4和AtPep5對AtPEPR1、AtPEPR2的誘導(dǎo)作用較弱；AtPep6對AtPEPR1有較弱的誘導(dǎo)，但是對AtPEPR2無影 響［13］。不同的AtPep對AtPEPR1和AtPEPR2的誘導(dǎo)程度不同暗示著，AtPEPR1和AtPEPR2可能在介導(dǎo)不同Pep的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中存在一定的分工。確實(shí)，在擬南芥中AtPEPR對Pep的識別具有一定的特異性。AtPEPR1能夠識別所有的AtPep，而AtPEPR2則主要識別AtPep1和AtPep2［13，19，21］。此外，也有研究表明AtPEPR1和AtPEPR2介導(dǎo)的Pep信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要具有胞外結(jié)構(gòu)域的受體激酶BAK1和一些沒有胞外結(jié)構(gòu)域的類受體胞質(zhì)激酶（如BIK1和PBL1）的參與［28］。

Pep-PEPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在不同植物中顯示出一定的不相容性，AtPep1只能被擬南芥及其近緣的植物識別，不能被親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物所識別。但Pep-PEPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系在不同植物中也具有一定的保守性：用擬南芥AtPep1、番茄SlPep6和玉米ZmPep1分別處理瞬時(shí)表達(dá)AtPEPR1、SlPEPR1和ZmPEPR1a的煙草葉片，都能夠激活下游信號通路，說明受體PEPR下游的激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊具有較強(qiáng)的保守性［8］。

2015年，Tang等［29］報(bào) 道 了AtPEPR1的 胞 外LRR結(jié)構(gòu)域（PEPR1LRR）與AtPep1結(jié)合形成的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)顯示，AtPep1與超螺旋形態(tài)的PEPR1LRR的內(nèi)表面結(jié)合。AtPep1 C端的最后一個(gè)氨基酸Asn23在與PEPR1LRR結(jié)合的過程中起到了十分關(guān)鍵的作用，突變Asn23會嚴(yán)重影響AtPep1與PEPR1LRR的 結(jié) 合。AtPep1與AtPEPR1的LRR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合會誘導(dǎo)AtPEPR1與共受體BAK1的異源二聚化（圖3），進(jìn)而將信號傳遞至下游。

圖3 Pep-PEPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)控生長發(fā)育、免疫防御機(jī)制Fig.3 Pep-PEPR signal transduction and the mechanisms underlying their regulation of plant growth，development and defense

2.2 受體復(fù)合體的內(nèi)吞

受體復(fù)合體的內(nèi)吞在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用［30］。有研究表明，Pep與受體PEPR結(jié)合之后也會發(fā)生內(nèi)吞，且這種內(nèi)吞對Pep的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用。Ortiz-Morea等［31］利用熒光標(biāo)記的Pep（TAMRA-pep）證實(shí)了Pep的內(nèi)吞依賴于PEPR：AtPep1可以被野生型擬南芥的根細(xì)胞內(nèi)吞，但不能被pepr1pepr2突變體的根細(xì)胞內(nèi)吞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AtPep1-AtPEPR1復(fù)合體的內(nèi)吞依賴于網(wǎng)格蛋白（clathrin）。在網(wǎng)格蛋白突變體chc2（clathrin heavy chain 2）中，AtPep1的內(nèi)吞作用受到抑制，且對AtPep1的響應(yīng)程度減弱。2020年Collins等［32］發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)格蛋白銜接子EPSIN1（EPS1）可以調(diào)節(jié)AtPEPR1等模式識別受體和共受體BAK1在細(xì)胞膜上的積累，從而影響Pep等免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 Pep的生物學(xué)功能

3.1 Pep調(diào)控植物生長發(fā)育

3.1.1 抑制植物生長 外源施加AtPep1能夠明顯抑制植物生長。在擬南芥Pep的兩個(gè)受體中AtPEPR2在介導(dǎo)AtPep1的根系生長抑制起主導(dǎo)作用［15，33-34］。Col-0和pepr1對AtPep1的根生長抑制效應(yīng)具有相似的敏感性，但pepr2單突變體和pepr1pepr2雙突變體的根則對AtPep1幾乎完全不敏感。轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)，根中AtPep1調(diào)控的基因中有75%基因表達(dá)完全依賴于AtPEPR2［8，27］。

Pep可能通過影響植物激素信號途徑，從而調(diào)控植物生長。Pep可以影響生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN2（PIN-FORMED2，PIN2）和PIN3在根中的分布及豐度，從而改變生長素的局部分布，進(jìn)而影響根系生長［15］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)AtPep1能夠誘導(dǎo)JA相關(guān)基因表達(dá)，而JA能夠抑制植物主根的生長［35］，因此Pep的根系生長抑制效應(yīng)可能也與JA途徑相關(guān)。

除與植物激素途徑互作外，Pep對植物根生長的抑制作用也可能與ROS及氨基酸的合成相關(guān)。Kadota等［36］發(fā) 現(xiàn)，AtPEPR2結(jié) 合AtPep1后，能夠磷酸化BIK1（botrytis-induced kinase 1），BIK1能夠進(jìn)一步磷酸化并激活ROS合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵酶RBOHD和RBOHDF，從而促進(jìn)ROS生成，抑制根系生長［37］。2014年Ma等［27］發(fā)現(xiàn)，AtPep1能夠抑制谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glutamine dumpers genes，GDU）介導(dǎo)的氨基酸外排，導(dǎo)致氨基酸在根細(xì)胞中過度積累，從而抑制根生長；過表達(dá)GDU3的擬南芥表現(xiàn)出短根的表型，并對AtPep1介導(dǎo)的根生長抑制效應(yīng)不敏感。

3.1.2 調(diào)控衰老 Pep可以通過誘導(dǎo)葉綠素降解和自噬，加速黑暗或者饑餓誘導(dǎo)的葉片衰老。外源Pep處理能夠加速野生型擬南芥葉片黃化，而對pepr1pepr2雙突變體植株則沒有效果。黑暗或饑餓處理可以誘導(dǎo)AtPep3的前體蛋白編碼基因AtPROPEP3的表達(dá)，而AtPep3能夠快速誘導(dǎo)葉綠素降解基因PAO以及自噬基因APG7和APG8a的表達(dá)，激活葉綠素降解和自噬途徑［14］。

3.2 Pep調(diào)控植物抗性反應(yīng)

3.2.1 非生物脅迫 AtPep3正調(diào)控植物耐鹽反應(yīng)。在鹽脅迫處理下，AtPROPEP3基因的表達(dá)顯著上調(diào)。外源施加AtPep3可以抑制鹽脅迫下的幼苗葉片白化，提高擬南芥的耐鹽性，而AtPROPEP3基因的敲除突變體則對鹽脅迫超敏。進(jìn)一步研究表明，AtPep3對植物耐鹽性的促進(jìn)作用主要由AtPEPR1介導(dǎo)。AtPep3處理能夠提高野生型擬南芥或pepr2單突變體的耐鹽性，但對pepr1和pepr1pepr2雙突變體卻沒有效果［17］。此外，鹽脅迫能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)葉片中AtPROPEP3和AtPEPR1的表達(dá)，這也佐證了AtPep3與AtPEPR1在調(diào)控植物耐鹽性中的作用［21］。然而，AtPep3/AtPEPR1如何調(diào)控植物耐鹽性還有待進(jìn)一步研究。

3.2.2 生物脅迫 Pep能夠正調(diào)控植物對多種細(xì)菌和真菌的抗性。擬南芥pepr1和pepr2單突變體以及pepr1pepr2雙突變體對丁香假單胞菌Pst DC3000的抗性明顯弱于野生型植物［13］。有研究表明，Pep可以通過調(diào)節(jié)氣孔開閉狀態(tài)，影響植物對丁香假單胞菌的抗性。當(dāng)野生型擬南芥中受到Pst DC3000侵染時(shí)，AtPEPR1或AtPEPR2識別Pep并招募共受體BAK1，然后磷酸化并激活下游BIK1。活化的BIK1從受體復(fù)合物中釋放，激活保衛(wèi)細(xì)胞S型陰離子通道SLAC1（SLOW ANION CHANNEL1）和SLAH3（SLAC1 HOMOLOG3），導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。而pepr1pepr2突變體受到Pst DC3000侵染時(shí)，其葉片上的氣孔不能及時(shí)關(guān)閉，導(dǎo)致其更加感?。?8］。此外，AtPep1也可以增強(qiáng)植物對腐生型病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性［28］。

除了調(diào)控植物對病原菌的抗性外，Pep也調(diào)控對食草動物的抗防御反應(yīng)。擬南芥在受到食草動物噬咬時(shí)，AtPEPR1、AtPEPR2以及AtPROPEP3基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與野生型擬南芥相比，pepr1pepr2雙突變體對斜紋夜蛾幼蟲（Spodoptera littoralis larvae）的抗性降低，且茉莉素的積累量減少，說明茉莉素途徑可能介導(dǎo)了Pep對植物抗蟲反應(yīng)的調(diào)控［10］。

Pep調(diào)控植物免疫的功能在雙子葉和單子葉植物中似乎是保守的。玉米Pep分子ZmPep1與AtPep1存在很多功能上的相似性。ZmPep1處理可以誘導(dǎo)茉莉素和乙烯的合成，促進(jìn)相關(guān)防御基因的表達(dá)，提高玉米對南方葉枯病（southern leaf blight）以及炭疽?。╝nthracnose stalk rot）的抗性［7］。此外，昆蟲口腔分泌物處理能夠誘導(dǎo)ZmPROPEP1和ZmPROPEP3的表達(dá)，且外源施加ZmPep3能夠提高植物對食草動物的抗性。

4 總結(jié)與展望

植物在自然環(huán)境中的生長往往會受到各種生物或非生物脅迫的影響。植物為適應(yīng)環(huán)境，進(jìn)化出一系列的防御機(jī)制以應(yīng)對這些脅迫［39-41］。Pep作為新近鑒定到的一類在被子植物中普遍存在內(nèi)源短肽分子，在植物的生長發(fā)育和抗性反應(yīng)中都表現(xiàn)出重要的調(diào)節(jié)作用。本文綜述了Pep的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，介紹了Pep對根的生長、葉片衰老等植物生長發(fā)育過程的調(diào)控，并闡述了Pep在植物應(yīng)對病原菌、昆蟲、高鹽等生物和非生物脅迫中的作用。

盡管我們對Pep的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和生物學(xué)功能已有不少了解，但目前仍有許多問題有待進(jìn)一步探究。比如，（1）Pep作為植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種內(nèi)源短肽，是如何釋放到胞外空間的；（2）在擬南芥中，不同Pep與受體PEPR之間的結(jié)合表現(xiàn)出了一定的特異性，這種特異性的生化基礎(chǔ)和生物學(xué)意義是什么；（3）Pep-PEPR受體復(fù)合物的內(nèi)吞是如何影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的；（4）Pep在植物中能否長距離移動，是否可作為一種系統(tǒng)性防御信號；（5）在機(jī)械損傷或昆蟲噬咬過程中，Pep信號與JA、ROS、鈣離子等信號的時(shí)序關(guān)系是怎樣的，又是如何相互作用的；（6）Pep短肽的代謝或降解機(jī)制；（7）在擬南芥中，干擾ROS或Auxin信號途徑不能完全模擬Pep對根生長的抑制作用［15，37］，那么還有哪些其他的信號途徑參與Pep介導(dǎo)的植物生長抑制；（8）Pep-PEPR在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抗性反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用，這兩方面的作用是如何平衡的。

近年來，除Pep外，有越來越多的短肽類植物內(nèi)源信號分子被發(fā)現(xiàn)，它們分別在植物生長發(fā)育或抗性等方面發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。如：CLV2短肽能夠調(diào)控不同溫度下擬南芥花的發(fā)育［42］，而RALF短肽則可以調(diào)控植物根的生長［43］和抗性［44］等。對Pep的系統(tǒng)研究，不僅能夠拓展和深入人們對Pep系列短肽分子功能和作用機(jī)制的認(rèn)識，也將為其他類型植物短肽的研究提供范例。此外，外源施加Pep在提高植物耐鹽性和病原菌及昆蟲抗性等方面展現(xiàn)出了較顯著的效果，且這種作用在不同種類的植物中可能相對保守，在農(nóng)作物中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，隨著多肽商業(yè)合成成本的下降，Pep等短肽類分子有望作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑或生物農(nóng)藥，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。