王婷 楊陽 李金萍 杜坤

（1. 揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009；2. 揚州大學生命科學基礎實驗教學中心，揚州 225009）

轉基因（genetically modified，GM）作物是一類利用基因工程技術將外源的有益基因導入到作物基因組中并穩(wěn)定遺傳，以獲得更加優(yōu)良的農藝性狀和經濟價值的作物。自1996年第一例轉基因作物商業(yè)化應用以來，各種轉基因作物不斷問世，且種植面積也不斷擴大。目前，全球共有27種轉基因作物的387個轉化體被批準可用作糧食或飼料。全轉基因作物的總種植面積從1996年的170萬公頃增加到2018年的191.7萬公頃（ISAAA，2019）。根際導入外源基因的類別，可以把轉基因作物分為4類：（1）耐除草劑類，（2）抗蟲類，（3）抗病類，（4）其他（品質相關、抗逆等）。

由于外源基因來源的多樣化和植物發(fā)育的不可預測性，轉基因作物商業(yè)化種植之前都必須通過系統、深入的環(huán)境安全性評價［1］。其中，土壤作為生態(tài)系統中物質循環(huán)和能量轉化的重要場所，對外界環(huán)境的變化比較敏感，已被公認為是生態(tài)系統變化的預警指標之一［2］。本文綜述近年來國內外學者關于轉基因作物對土壤微生物群落影響方面的研究進展，并對轉基因作物土壤安全評價中還應注意的問題進行了探討和展望。

1 土壤微生物群落的研究方法

隨著現代生物技術的發(fā)展，土壤微生物群落的主要研究方法有微生物平板培養(yǎng)法、Biolog微孔板法、生物標記物法和高通量測序技術4類。

土壤中的微生物可以通過經典的微生物平板培養(yǎng)方法直接檢測出，但土壤微生物種類繁多，可培養(yǎng)的微生物只占所有土壤微生物的10%左右［3-4］，這種方法只能反映出土壤中一部分微生物的變化情況。因此，微生物平板培養(yǎng)法現在大多被用來篩選一些具有某些特定功能的可培養(yǎng)微生物。

Biolog微孔板法是根據微生物對特定碳源利用方式的差異，來測算微生物群落代謝的功能多樣性，即細菌群落代謝指紋［5］。Biolog微孔板有多種類型，目前以Biolog-ECO 1506應用最為廣泛。它含有3組縱向排列的平行重復，每組含有31種碳源（分別是糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類六大類）和1個空白對照。由于不同微生物對碳源的利用方式有一定差異，因此就可用于比較不同微生物群落之間的代謝差異。這種方法已被廣泛的應用于評價轉基因作物（如玉米、水稻、小麥和大豆）對根際土壤微生物群落的影響［6-9］。Biolog微孔板法雖然具有靈敏度高、培養(yǎng)周期短、檢測簡便等優(yōu)點，但也存在一些局限性，如人工培養(yǎng)條件對實驗結果的影響等［10］。

土壤微生物主要由細菌、真菌和放線菌等組成，不同微生物細胞膜中特定化合物（如醌和脂肪酸）的類型和含量存在一定差異，將這些化合物作為生物標記物，就可實現對微生物群落結構的定量分析，其中應用最多的就是磷脂脂肪酸（PLFA）圖譜法［11］。常用的細菌特征PLFA有i15：0、a15：0、15：0、i16：0、16：1ω9、16：1ω7t、i17：0、a17：0、17：0、18：1ω7、cy19：0，真 菌 特 征PLFA有18：1ω9、18：2ω6、18：3ω3；革蘭氏陽性菌的特征PLFA有16：0（10Me）、17：0（10Me）、18：0（10Me）、i15：0、a15：0、i16：0、i17：0、a17：0，革蘭氏陰性菌的特征PLFA有16：1ω5、16：1ω7t、16：1ω9、cy17：0、18：1ω5、18：1ω7和cy19：0［12］。由于PLFA方法直接以土壤微生物群落中的脂肪酸為研究對象，解決了傳統微生物培養(yǎng)方法中缺失不可培養(yǎng)微生物信息的問題［13］。但是，PLFA生物標記方法只適用于活的微生物，且不同種類的微生物可能會產生重疊的圖譜，故此方法一般被用作為微生物群落研究的一種必要補充。

分子檢測技術對微生物群落結構的變化十分敏感，可以檢測細菌組成的微小差異，其在探索微生物群落多樣性，尤其是鑒定微生物新物種方面發(fā)揮了一定的優(yōu)勢。常用的方法有熒光原位雜交法（FISH）、DNA微陣列法、單鏈構象多態(tài)性（SSCP）法、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）法、擴增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）法、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）法、變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）法等。其中，DGGE技術是被運用于土壤微生物群落研究中最多的方法。這些分子生物學方法具有靈敏度高、不用培養(yǎng)微生物等優(yōu)點，可以更好的反應土壤微生物的真實狀況。但是缺點也很明顯，如DGGE中能夠檢測到的微生物群落通常是具有顯著優(yōu)勢度的菌落，同一條帶可能代表DNA分子遺傳圖譜中的多種微生物物種［14］。

隨著分子生物學研究的快速發(fā)展，尤其是下一代測序（NGS）技術的廣泛應用，極大的提高了土壤微生物學的研究廣度和深度［15-16］。高通量測序技術主要包括 454 焦磷酸、ABI SOLiD、Illumina Hiseq 2000 及Illumina Miseq、Hecos Heliscope和PacBio Sequel測序平臺。近年來，這些高通量測序已逐漸代替了DGGE技術，尤其是以單分子和長讀長為主要特征的三代測序技術，逐漸成為微生物群落研究領域的主要分析方法［17］。如PacBio 16S擴增子測序技術，首先對細菌16S rRNA基因的擴增測序結果（raw reads）進行校正、過濾和去除嵌合體序列，得到有效數據（clean reads），然后將clean reads聚類為OTUs，并對其進行物種注釋，獲得分類學信息。再使用Qiime等軟件計算Observed-OTUs，Chao1，Shannon，Simpson等Alpha多樣性指數，計算Unifrac距離，構建PCoA和UPGMA聚類樹圖，并進行組間差異分析。最后運用Anosim、MRPP、ADONIS、t-test等統計分析方法對組間物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗。

宏基因組測序是以特定生境中的整個微生物群落作為研究對象，直接提取環(huán)境樣本DNA，通過采用新一代測序技術，獲得環(huán)境微生物基因信息的總和［18］。與高通量測序不同的是，Clean Reads需經過Metagenome 組裝后，進行常用功能數據庫、抗性基因數據庫的注釋和一系列高級信息分析（如CCA/RDA分析，拷貝數變異分析等）。同時，還可結合環(huán)境因子、病理指標或特殊表型進行深入關聯分析。宏基因組測序技術避免了實驗中由環(huán)境引起的微生物變化的差異，更真實地反應樣本中微生物組成和互作情況，可在分子水平對其代謝通路、基因功能進行更加深入的研究［19］。宏轉錄組測序是指從整體水平上研究某一特定環(huán)境，特定時期群體生命所有基因組的轉錄情況以及轉錄調控規(guī)律。相較于宏基因組測序，它以生態(tài)環(huán)境中的全部RNA為研究對象，從轉錄水平上研究復雜微生物群落的變化，可以更好的挖掘潛在的新基因［20］。

2 轉基因作物對土壤微生物影響的研究進展

轉基因作物在給我們帶來效益的同時，外源基因的導入是否會引起土壤生態(tài)風險，這是我們急需回答的問題。為此，國內外研究學者做了大量的研究工作，但目前還沒有明確的結論表明轉基因作物是否一定會對土壤微生物生態(tài)系統產生持續(xù)、不利的影響。

2.1 抗蟲類轉基因作物

已轉入作物中的抗蟲類基因主要包括：蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因、核糖體失活蛋白基因和豌豆脂肪氧化酶基因等［21］。目前，在評估抗蟲類轉基因作物對非靶標土壤微生物影響的研究中，最多的是Bt基因和CpT1基因（表1）。

表1 抗蟲類轉基因作物對土壤微生物群落的影響Table 1 Impact of insect-resistant GM crops on soil microbial communities

上述研究中，大多數研究發(fā)現轉基因抗蟲作物對根際土壤微生物群落無顯著影響，或遠小于作物不同生育期和種植年份。如在轉基因棉花中，研究學者已經運用多種研究方法（包括CFUs、qPCR、T-RFLP、PCR-DGGE和16S rRNA基因高通量測序）分析了轉CrylAc+CpTI 基因棉花對根際土壤微生物的影響。結果表明，轉基因棉花根際土壤中的細菌和真菌的優(yōu)勢菌群種類、物種相對豐度、群落多樣性等指標與對照相比差異并不顯著［28，30，32-33，40］。Liang等［41］的高通量測序結果顯示，轉Cry1Ie 基因玉米和非轉基因玉米的根際土壤細菌豐富度和多樣性指數以及群落結構均無顯著差異，而主成分分析卻顯示苗期、花期、成熟期之間或不同試驗年份之間的卻存在顯著差異。

另一方面，Zhu等［45］和Han等［47］利用同位素探測技術結合基因克隆文庫分析顯示，雖然Bt水稻、親本Ck和遠源親本Dp三種水稻的根際土壤中占優(yōu)勢的微生物都是產甲烷古菌群落，但其中Bt水稻根際活躍的產甲烷古菌群落以甲烷八疊球菌科、甲烷鬃菌科和甲烷微菌科為主，而Ck和Dp水稻根際只有兩個主要產甲烷菌群（甲烷鬃菌科和甲烷微菌科）。這些結果表明，將Cry1Ab/1Ac基因插入水稻基因組中，有可能通過改變根系產甲烷底物的分泌（如氨基酸、糖、可溶性碳水化合物、檸檬酸、乙酸和總有機酸等）、根系衰老過程或光合作用等其他途徑，改變了水稻根際產甲烷群落的結構組成。Van wyk等［48］通過Illumina MiSeq 測序技術研究了成熟期Bt玉米和非Bt玉米的根際土壤細菌物種多樣性和群落結構。結果表明，兩者細菌alpha多樣性和群落組成存在顯著差異，變形菌門和酸桿菌門是Bt玉米根際土壤的優(yōu)勢菌，而非Bt玉米根際土壤的優(yōu)勢菌則是放線菌門。通過進一步研究，發(fā)現Bt玉米與對照根際土壤的有機碳、硝酸鹽含量以及土壤酸性磷酸酶和β-葡萄糖苷酶活性也存在顯著差異。這些土壤理化性質和相關酶活性的差異可能是導致細菌群落結構不同的主要原因。

2.2 抗病類轉基因作物

在評估抗病類轉基因作物對土壤微生物群落影響的研究中，研究較多的是轉抗真菌和抗植物病毒基因的作物品系（表2）。

表2 抗病類轉基因作物對土壤微生物群落的影響Table 2 Influence of disease-resistant GM crops on soil microbial communities

表達具有抗菌活性的外源蛋白（如幾丁質酶、葡聚糖酶和溶菌酶），是一種提高作物抗病能力的主要分子育種手段。幾丁質酶可以通過分解真菌細胞壁來實現抗真菌的特性，但據現有的文獻報道，表達幾丁質酶的轉基因作物對非目標和潛在有益的微生物群落并沒有產生不良影響。Khan等［50-51］的研究發(fā)現，轉幾丁質酶基因甘藍型油菜對根際土壤細菌、真菌和放線菌數量、多樣性和群落結構均無顯著影響，兩者間5種土壤酶活性（β-葡萄糖苷酶、脲酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶和磷酸單酯酶）也無顯著差異，但不同品種之間土壤的細菌和真菌群落結構差異顯著。Shahmoradi等［52］通過盆栽實驗，對轉幾丁質酶基因棉花T2代植株的根際和根區(qū)土壤微生物進行了CFUs和PCR-DGGE分析，結果顯示，雖然根際土壤中的細菌群落會隨生育期（幼苗、花蕾、開花和鈴期）的變化而發(fā)生顯著的改變，但同一生育期轉幾丁質酶棉花的根際細菌的群落結構和功能菌數量與對照差異不顯著。此外，Bidondo等［53］和Stephan等［54］在盆栽條件下，利用RFLP技術監(jiān)測了過表達抗真菌活性肽基因的轉基因馬鈴薯對叢枝菌根真菌定殖的影響，結果表明轉基因馬鈴薯叢枝菌根真菌的定殖和共生關系與對照相比沒有顯著的差異。以上結果表明，像幾丁質酶這些具有廣譜抗菌功能的蛋白可能并不會通過植物根系分泌至土壤中，或者說在植物體內表達的這些蛋白隨著植物的衰老、凋亡并不會大量的釋放到土壤環(huán)境中，因此沒有顯著改變土壤微生物的群落多樣性和結構。

作物中導入一些植物病毒外殼的相關基因，如小麥黃花葉病毒（WYMV），已被證實可以顯著提高對特定植物病毒的抗性。病毒外殼蛋白在轉基因植物的所有部位均有表達，可能會對根際土壤微生物有潛在的非靶向效應。Wu等［55］分析了2個耕作年份轉WYMV-Nib8基因小麥對土壤微生物群落結構的影響。結果顯示，與受體揚麥相比，除第1年的灌漿期，其他時期（包括第2個試驗年份）轉基因小麥對土壤細菌的Shannon、Simpson和Evenness三個alpha多樣性指數的影響不顯著；除第1年苗期和第2年的成熟期外，轉基因小麥與受體根際土壤真菌群落多樣性差異也不顯著。這些結果說明，WYMVNib8基因的導入并未對土壤根際微生物的群落產生較長期的影響。Zhang等［56］采用PCR-DGGE和Biolog微生態(tài)板法研究了轉WYMV RdRp基因小麥和親本小麥的根際微生物群落，發(fā)現不同生育期間（苗期、莖伸長期、花期和成熟期）物種相對豐度和微生物群落碳源利用能力存在明顯不同，而不同基因型間的根際微生物群落結構和功能多樣性指數沒有顯著差異，根際細菌多樣性主要與土壤含水量、有效磷、pH等環(huán)境因子高度相關。

2.3 抗除草劑類轉基因作物

轉抗除草劑基因作物中運用最多的是抗草甘膦基因和抗草銨膦基因。其中，抗草甘膦基因有7種，分 別 是cp4 epsps、gat4601、goxv247、epsps、epsps grg23ace5、mepsps、2mepsps，抗草銨膦基因主要有bar和pat兩種［57-58］（表3）。

表3 抗除草劑類轉基因作物對土壤微生物群落的影響Table 3 Effects of herbicide-resistant GM crops on soil microbial communities

和抗蟲轉基因作物的研究結果相似，評估抗除草劑類轉基因作物對土壤微生物生態(tài)系統的影響研究中，也存在兩種結果。一方面，大多數結果表明作物中轉入抗除草劑基因對土壤微生物群落沒有造成特異性的影響，而主要受季節(jié)和植物發(fā)育的影響較大。Vital-Lopez等［59］通過PCR-DGGE圖譜分析，表明溫室條件下轉pat基因玉米對根際土壤細菌群落結構的影響不顯著。Tang等［60］采用16S rRNA基因高通量測序技術，發(fā)現抗草銨膦油菜對根際細菌群落alpha多樣性沒有較大影響，相對豐度中較高的優(yōu)勢菌為變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門，這些優(yōu)勢門在施用草銨膦的轉基因油菜和非轉基因受體油菜中都高度存在，但卻在油菜的不同生育期（苗期、抽薹期、開花期和成熟期）存在顯著的差異。而另一方面，也有一些研究表明，在較長時間的作用下，一些轉抗除草劑基因作物會影響土壤中部分微生物的相對豐度，進而改變微生物群落的組成。Babujia等［64］對抗草甘膦轉基因大豆進行了長達10年的田間監(jiān)測，雖然抗草甘膦基因的導入并未對大豆的產量產生影響，但是通過宏基因組測序分析發(fā)現常規(guī)大豆根際土壤細菌群落中放線菌和酸桿菌豐富，而轉基因大豆則變形菌、厚壁菌和綠藻相對豐度較高，與蛋白質代謝、細胞分裂周期相關的序列豐度也較高。He等［66］對成熟期細菌的16S rRNA基因進行了Illumina MiSeq測序發(fā)現，轉bar基因水稻與常規(guī)水稻的土壤細菌多樣性指數差異不顯著，但是轉基因粳稻和常規(guī)品種之間個別屬的豐度（如綠絲菌屬）存在顯著差異，且轉基因粳稻土壤中的厭氧菌含量顯著高于常規(guī)水稻。

3 轉基因作物土壤微生物生態(tài)風險評價中還應考慮的因素

雖然上述大量的研究結果顯示作物土壤微生物生態(tài)系統主要和環(huán)境、氣候、土壤類型、作物種類等密切相關，通過分子育種手段將外源有益基因導入到作物中，從短期來看并不會對土壤微生物的多樣性指數和群落結構等產生較大的、持久的、不利的影響，但是確實也有一些證據表明，轉基因事件可能會影響土壤中個別微生物種群的豐度，或者在某個特定時期影響微生物的多樣性。因此，為了能夠更加科學、準確、全面地評價轉基因作物對土壤微生物的潛在風險，我們認為還應當考慮以下因素。

3.1 轉基因產物在土壤中的持久性

轉基因作物在生長發(fā)育時期，往往會通過根系向土壤中釋放外源蛋白，其降解速率，或著說殘留時間，也是影響土壤微生物群落的重要因素之一。Wang等［4］對Bt水稻土壤中Cry1Ab/1Ac蛋白的豐度和持久性等動態(tài)過程進行了為期3年的田間監(jiān)測。結果顯示，Bt水稻在生育期可通過根系向土壤和農田水體中持續(xù)釋放Cry1Ab/1Ac蛋白，但是在土壤中可檢測到的Bt蛋白不會持續(xù)存在超過2個月，并且其流動性不強，不會隨著灌溉水進入相鄰的土壤。Strain等［68］的研究卻發(fā)現，Bt蛋白會通過地表徑流和作物殘留物被運輸到附近的河道中，以致在非Bt玉米田中也檢測到了Cry1Ab蛋白，且沉積物類型和溫度對水中Cry1Ab蛋白的降解時間有一定的影響，最長可達2個月。

3.2 標記基因對土壤微生物的影響

標記基因主要用于陽性轉化體的篩選，除了目的基因，這些標記基因也有可能會影響土壤微生物的群落，而這部分的研究報道較少。LeBlanc等［69］將CryIAb、uidA和nptII基因導入白云杉中，并對其根際微生物群落進行了研究。結果顯示，轉3種基因的與僅攜帶uidA和nptII標記基因的白云杉以及對照根際微生物物種相對豐度存在顯著差異，說明uidA和nptII標記基因的導入也會對土壤根際微生物群落結構產生顯著的影響。綠色熒光蛋白（GFP）也在植物遺傳轉化系統中有著廣泛的應用。Lv等［70］發(fā)現，含GFP基因的煙草與對照野生型相比，在整個生育期（幼苗期、營養(yǎng)期、花期和衰老期）對土壤微生物種群沒有產生顯著影響。因此。標記基因對土壤微生物生態(tài)系統是否安全也存在爭議，需要進一步的研究。

3.3 田間管理對土壤微生物的影響

輪作方法，肥料、殺蟲劑和除草劑的使用等這些田間管理措施對土壤微生物也有著較大的影響。如種植轉Bt基因作物會減少殺蟲劑的使用，因此在這種情況下，還應同時評估農藥用量的變化對土壤微生物產生的影響。再如，種植抗草甘膦作物的田間管理模式主要表現為免耕和除草劑的大量使用，這也會在一定程度上影響土壤的微生物群落［71-72］。Lupwayi等［7］用5年時間比較了抗草甘膦、抗草銨膦轉基因玉米和常規(guī)品種在除草劑噴施、不同輪作方式等條件下的土壤細菌群落。在5個耕作年中，未發(fā)現Bt基因轉化、殺蟲劑施用或輪作對根際土壤微生物多樣性產生影響，但卻發(fā)現輪作2種Bt轉基因玉米的非根際土壤微生物總量、功能多樣性和土壤酶活性均高于1種Bt轉基因玉米單作和常規(guī)玉米輪作。

一些研究學者認為長期種植轉基因作物而導致的這些大田管理模式的變化會帶來嚴重的生態(tài)和農藝問題，包括抗除草劑雜草的蔓延、土壤的腐蝕、土壤肥力和養(yǎng)分的喪失、物種和生物多樣性的喪失等［73-74］。例如轉基因大豆單作規(guī)模的擴大造成了農業(yè)生產的大規(guī)模集約化，土壤肥力下降和土壤腐蝕的加劇，也導致了部分土壤不能再持續(xù)利用。因此，我們在開展轉基因作物土壤微生物生態(tài)風險評價工作中也應該考慮這些因素。

4 展望

土壤微生物在農業(yè)生產系統中發(fā)揮著極其重要的作用，外源基因的導入可能會影響植物的新陳代謝和根系分泌物的產生，從而改變土壤微生態(tài)環(huán)境。因此，我們要深入開展轉基因作物對土壤生態(tài)系統的風險評估工作。轉基因作物土壤生態(tài)系統安全風險的核心是要評估轉基因作物的種植是否會改變土壤生態(tài)系統的功能。研究表明，土壤微生物多樣性和功能之間沒有內在的必然聯系，物種豐富度的改變并不會對土壤功能產生實質性影響［75-76］。目前，只有極少數研究顯示轉基因作物可能會對土壤微生物功能多樣性產生短暫的影響。如張卓等［63］利用Biolog微孔板法發(fā)現，抗草甘膦轉基因大豆成熟期的土壤微生物碳源利用能力顯著高于受體材料，但與另一常規(guī)種植品種無顯著差異，到殘茬期三者又均無顯著性差異了。

迄今為止，已有大量的研究評估了轉基因作物對土壤微生物存在的潛在影響，但是由于這些研究的對象（包括外源基因和植物物種）、環(huán)境、實驗方法等均不完全相同，所得數據也用不同的方法進行分析，再加之大多數的研究結果都只是在1-2年的栽培期的基礎上得出的，因此結果必然會顯示出一定的差異。在未來的分子育種實踐中，可能還會開發(fā)出更多的多性狀疊加的轉基因作物，這會對轉基因環(huán)境安全評價工作帶來更多的挑戰(zhàn)，研究內容也會更加復雜。正是由于當前研究具有上述這些局限性，我們在今后的工作中，更應當重視土壤微生物群落結構組成和功能之間相關性及其對土壤系統自然變化（如季節(jié)、氣候、輪作和農藥使用）的響應等方面的研究，從而能夠更加全面、準確的評估轉基因作物對土壤微生物的影響程度。

轉基因作物的安全風險評估是一項長期而艱巨的任務，我們相信隨著時間的推移，人們可以更好、更全面地了解轉基因作物種植的利弊，為人類的糧食安全問題做出貢獻。