易疆鶯,滕文頂,王芳,王雪梅,鮮紅,張攀

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)是目前治療不孕癥的主要手段。對(duì)于一些特殊原因的不孕患者，如多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)、高齡婦女及卵巢早衰患者，其不成熟卵母細(xì)胞占比更高，如何將未成熟卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養(yǎng)使其具有受精和發(fā)育潛力，是廣大研究者一直探討的熱點(diǎn)[1-4]。IVM技術(shù)雖然很早就運(yùn)用于臨床治療，但尚未達(dá)到真正的成熟階段，與正常體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，IVM卵母細(xì)胞受精后的胚胎發(fā)育潛力較低。影響IVM的因素很多，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)是主要因素之一。ROS是一種強(qiáng)氧化劑，能破壞一系列的大分子物質(zhì)從而引起氧化性損傷導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯甚至死亡。原花青素是一種主要在葡萄皮、葡萄籽和綠茶中被發(fā)現(xiàn)的類黃酮物質(zhì)，作為天然的抗氧化物，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和化妝品行業(yè)[5]。研究表明，原花青素的氧自由基吸收能力遠(yuǎn)強(qiáng)于維生素C和維生素E[6]，能夠明顯降低自由基誘導(dǎo)的DNA損傷，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，從而提高其發(fā)育潛能。但有關(guān)原花青素對(duì)人類卵母細(xì)胞IVM及胚胎發(fā)育的影響鮮有報(bào)道。本研究通過在IVM培養(yǎng)液里添加原花青素以培養(yǎng)卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期中人未成熟卵母細(xì)胞，探討原花青素能否改善人未成熟卵母細(xì)胞IVM及胚胎發(fā)育潛能，為 IVM 培養(yǎng)體系的優(yōu)化和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選取2019年1月至2020年12月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院生殖健康與不孕癥科進(jìn)行ICSI治療周期321例。納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦染色體正常，控制性促排卵采用黃體中期長(zhǎng)方案，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物經(jīng)剝除顆粒細(xì)胞后鏡下觀察確定為未成熟卵母細(xì)胞，且每周期獲卵數(shù)大于5枚、不成熟卵母細(xì)胞占比小于30%；排除內(nèi)分泌疾病(高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常、糖尿病等)、傳染病及吸煙、酗酒、吸毒等不良嗜好。共收集未成熟卵母細(xì)胞(GV和MI)837枚，隨機(jī)分為對(duì)照組和原花青素組。對(duì)照組和原花青素組患者在平均年齡、不孕年限、不育因素及超排卵方案等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。ICSI注射精子來源于我院因單純女方因素行IVF-ET周期的男性患者，精液量約2～6 mL，濃度約60×106/mL，活率≥70%,活力(a+b)≥55%。本研究所用未成熟卵母細(xì)胞及精液經(jīng)患者充分知情后自愿捐獻(xiàn)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)(審查號(hào)：科研倫理預(yù)審【2020】46)，所有患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 體外成熟培養(yǎng)液的制備 IVM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(成都艾偉孚生物科技有限公司)，原花青素(Sigma，USA)溶于蒸餾水中，配制 10 mM 儲(chǔ)備液。對(duì)照組：在基礎(chǔ)IVM 培養(yǎng)液中加入0.075 IU/mL卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和0.075 IU/mL黃體生成素(luteinizing hormone，LH)；原花青素組：在基礎(chǔ)IVM培養(yǎng)液中加入0.075 IU/mL FSH、0.075 IU/mL LH和20 μM的原青花素儲(chǔ)備液。

1.2.2 未成熟卵母細(xì)胞的獲得 所有研究對(duì)象 ICSI周期均采用黃體中期長(zhǎng)方案控制性促排卵。當(dāng)至少1個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑>20 mm 或 3 個(gè)達(dá) 18 mm 時(shí)，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)8 000～10 000 U，36～37 h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。收集患者的卵母細(xì)胞，在37 ℃，6% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2～4 h后，用透明質(zhì)酸酶去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，收集未成熟的卵母細(xì)胞(包括MI期和GV期)用于本研究。

1.2.3 未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎培養(yǎng) 采用微滴培養(yǎng)，50 μL/滴，1枚/滴，各組培養(yǎng)液在使用前提前一天配制置于37℃，6% CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜。將不成熟卵母細(xì)胞(包括MI期和GV期)隨機(jī)分配到兩組培養(yǎng)液里培養(yǎng)，在對(duì)照組培養(yǎng)液里，GV期卵母細(xì)胞208枚，MI期卵母細(xì)胞198枚；在原花青素組培養(yǎng)液里，GV期卵母細(xì)胞221枚，MI期卵母細(xì)胞210枚。于 37℃ 6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞形態(tài)，以第一極體排出為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。GV期卵母細(xì)胞：可見生發(fā)泡；MI期卵母細(xì)胞：生發(fā)泡破裂消失，第一極體尚未排出；MII期卵母細(xì)胞：已排出第一極體。對(duì)成熟卵母細(xì)胞(MII期卵母細(xì)胞)按我院常規(guī)行ICSI，ICSI 操作后置于Vitrolife卵裂期培養(yǎng)液(Vitrolife，Sweden)中培養(yǎng)，16～18 h后進(jìn)行受精觀察，48 h及72 h后分別進(jìn)行卵裂期胚胎觀察評(píng)級(jí)。受精后約72 h將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(Vitrolife，Sweden)中繼續(xù)培養(yǎng)，96～120 h 后觀察囊胚形成情況。

1.2.4 相關(guān)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) ICSI后48 h和72 h卵裂期胚胎評(píng)級(jí)參考2009年Racowsky等[7]將細(xì)胞數(shù)、碎片、卵裂球均一度3個(gè)指標(biāo)整合在一起的評(píng)級(jí)形式，在胚胎發(fā)育速度正常的前提下形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：Ⅰ級(jí)：細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)均清晰，無顆粒及多核現(xiàn)象，碎片<5%；Ⅱ級(jí)：細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)可有顆粒，碎片<20%；Ⅲ級(jí)：細(xì)胞大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片<50%；Ⅳ級(jí)：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象，碎片≥50%。Ⅰ級(jí)與Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎為可利用胚胎。

囊胚期胚胎觀察、分期和評(píng)級(jí)參照1999年Gardner等[8]分期和評(píng)分：D5或D6對(duì)3、4、5、6期囊胚進(jìn)行評(píng)級(jí)，1期和2期不評(píng)級(jí)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)評(píng)級(jí)：A-ICM包裹緊密，很多細(xì)胞；B-ICM細(xì)胞較分散，僅少數(shù)細(xì)胞；C-ICM很少細(xì)胞；滋養(yǎng)層評(píng)級(jí)：A-很多細(xì)胞形成連續(xù)的上皮；B-較少的細(xì)胞形成疏松的上皮；C-僅很少幾個(gè)大細(xì)胞。

參照“人類輔助生殖技術(shù)胚胎實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)質(zhì)控專家共識(shí)”，ICSI受精率=(2PN卵子數(shù)+1PN卵子數(shù)+多PN卵子數(shù))/注射卵子總數(shù)×100%；可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=2期及2期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數(shù)×100%。

1.2.5 熒光染色 對(duì)兩組孵出囊胚的胚泡用熒光染料Hoechst33342進(jìn)行染色，參照Pursel等[9]的方法進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)，比較兩組中胚泡細(xì)胞總數(shù)的差異。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組GV期卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育情況比較

原花青素組的成熟率、可利用胚胎率、囊胚形成率均比對(duì)照組顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組受精率、卵裂率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 兩組GV期卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育情況比較

2.2 兩組MI期卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育情況比較

原花青素組的成熟率、可利用胚胎率、囊胚形成率均比對(duì)照組顯著提高，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組受精率、卵裂率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 兩組MI期卵母細(xì)胞體外成熟及發(fā)育情況比較

2.3 兩組胚泡總細(xì)胞數(shù)熒光染色比較

胚泡經(jīng)Hoechst33342染色后，在Nikon熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。結(jié)果顯示，不論是GV期還是MI期卵母細(xì)胞，原花青素組孵化囊胚細(xì)胞總數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組囊胚胚泡細(xì)胞總數(shù)比較(個(gè)，

3 討論

輔助生殖技術(shù)中促排卵的目標(biāo)是誘發(fā)多卵泡發(fā)育，在不引起卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)的前提下獲得適量的成熟卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)作為一項(xiàng)新的輔助生殖助孕技術(shù)，不僅能夠提高IVF和ICSI技術(shù)中未成熟卵母細(xì)胞的利用率，而且對(duì)于PCOS的不孕患者而言，還能夠減少OHSS的發(fā)生率，是一種治療PCOS不孕癥的有效方法[10-11]。同時(shí)對(duì)于贈(zèng)卵、女性腫瘤及癌癥患者的生育力保存，提供了更多的方法及保障，具有較好的發(fā)展前景[11-13]。卵母細(xì)胞成熟包括細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟兩方面。生發(fā)泡破裂，同源染色體分裂，卵周間隙出現(xiàn)及第一極體排出是細(xì)胞核成熟的標(biāo)志。細(xì)胞完成蛋白的磷酸化及去磷酸化以及細(xì)胞器的重新排列是細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。卵母細(xì)胞成熟過程受多種因素的影響，然而傳統(tǒng)生殖技術(shù)與體內(nèi)自然狀態(tài)下卵母細(xì)胞的成熟環(huán)境不同，未成熟卵母細(xì)胞在體外成熟率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊娠率等方面存在不足，所以還需要更多的研究來進(jìn)一步提高未成熟卵母細(xì)胞體外的成熟率，增加其利用率，為輔助生殖患者提供更多的可利用胚胎，提高累計(jì)妊娠率。

與體內(nèi)自然狀態(tài)卵母細(xì)胞及胚胎的成熟環(huán)境相比，體外的培養(yǎng)環(huán)境氧分壓比較高，會(huì)導(dǎo)致ROS的生成增加，ROS是氧的衍生分子，屬于強(qiáng)氧化劑，能與任何分子發(fā)生氧化反應(yīng)，從而改變后者的結(jié)構(gòu)與功能[14]。在體內(nèi)存在著有效去除ROS的酶促機(jī)制和非酶促機(jī)制，但在體外缺乏這樣的保護(hù)機(jī)制，因而造成了氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。氧化應(yīng)激是一種不平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體抗氧化防御能力與ROS產(chǎn)量之間不平衡時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[15]。因氧化應(yīng)激與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA損傷有關(guān)[16]，有可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞基因表達(dá)異常，影響細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟，造成卵母細(xì)胞成熟阻滯，使受精率和發(fā)育能力下降，進(jìn)而引起胚胎發(fā)育不良、流產(chǎn)、出生缺陷及兒童期癌癥[17-20]，所以備受研究者的廣泛關(guān)注。在培養(yǎng)液中加入抗氧化劑可以減少氧化應(yīng)激損傷，Zavareh 等[21]在培養(yǎng)液中加入a-硫辛酸，降低了ROS含量，提高了抗氧化能力，促進(jìn)了卵母細(xì)胞IVM。Mokhber 等[22-23]的研究結(jié)果表明，適宜濃度的藏紅花素(100 g/mL)及藏紅花水提取物(40 g/mL)可以增加谷胱甘肽濃度，保護(hù)卵母細(xì)胞，顯著提高卵母細(xì)胞成熟率和受精率。Paula-Lopes等[24]認(rèn)為體外培養(yǎng)過程中過量氧自由基的產(chǎn)生是造成胚胎體外囊胚發(fā)育率低的主要原因。Truong等[25]研究認(rèn)為，在卵母細(xì)胞及胚胎的培養(yǎng)液中添加抗氧化物質(zhì)，能夠提高其培養(yǎng)效率。胚泡的平均細(xì)胞數(shù)是決定胚胎能否在子宮內(nèi)膜著床并繼續(xù)發(fā)育的主要因素。如何降低自由基誘導(dǎo)的DNA損傷以保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激作用，找到優(yōu)化IVM技術(shù)的突破點(diǎn)，對(duì)抗氧化物質(zhì)的研究就成為了熱點(diǎn)。

原花青素是一種抗氧化物質(zhì)，本研究中，為確定抗氧化物質(zhì)原花青素對(duì)人未成熟卵母細(xì)胞IVM、受精及胚胎發(fā)育的影響，我們?cè)谌宋闯墒炻涯讣?xì)胞IVM培養(yǎng)液中添加20 μM的原花青素，結(jié)果顯示無論對(duì)于GV期還是MI期卵母細(xì)胞，原花青素均能顯著提高其體外成熟率、增加可利用胚胎率及囊胚形成率，且原花青素組孵化囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于對(duì)照組，這與Awaga等[26]在不育男性精液中添加原花青素有助于精子體外培養(yǎng)的研究結(jié)果一致。原花青素能顯著提高人類卵母細(xì)胞體外成熟率及胚胎的體外發(fā)育潛能，其原因可能是原花青素通過阻止或減少過氧化反應(yīng)鏈中游離氧自由基的形成使氧化鏈中斷，從而阻止細(xì)胞膜中脂質(zhì)的過氧化和由此引起的一系列損害進(jìn)而抑制其凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明原花青素是一種有效的抗氧化物質(zhì)，添加原花青素能夠促進(jìn)人類卵母細(xì)胞IVM，提高胚胎的體外發(fā)育潛力，增加胚泡細(xì)胞總數(shù)，為進(jìn)一步優(yōu)化體外培養(yǎng)體系提供了重要線索，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討其對(duì) IVM 臨床妊娠率及后代安全性等方面的影響，對(duì)開發(fā)新的 IVM培養(yǎng)液及改善 IVF 臨床結(jié)局有重要意義。