吸水和干燥條件下發(fā)菜核糖體代謝差異表達(dá)基因分析

胡進(jìn)紅，馬曉蓉，宋 繁，梁旺利，梁文裕，王玲霞

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021)

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種耐旱性極強(qiáng)的陸生固氮藍(lán)藻，分布在中國(guó)西北部干旱和半干旱的荒漠草原和荒灘戈壁等地區(qū)，生命周期中經(jīng)歷交替的脫水和復(fù)水過(guò)程，具有生物固氮和拓荒固沙的重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[1]。由于人們的亂采濫挖，導(dǎo)致發(fā)菜資源逐年減少，發(fā)菜已被列為國(guó)家一級(jí)野生保護(hù)植物。目前，有關(guān)發(fā)菜在吸水和干燥條件下的結(jié)構(gòu)變化、生理生態(tài)、基因和蛋白表達(dá)及蛋白修飾已有一些報(bào)道[2-3]，但有關(guān)發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的分子機(jī)制尚有許多未解之謎。

核糖體蛋白可直接或輔助調(diào)節(jié)多肽鏈的合成以及執(zhí)行核糖體外功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)白三葉中多胺物質(zhì)(PAs)下降從而影響核糖體蛋白表達(dá)下調(diào)是干旱脅迫適應(yīng)性減弱的部分原因[5]。低溫和干旱脅迫下，水稻根和莖中核糖體蛋白R(shí)PL14基因的表達(dá)量均相應(yīng)增加[6]，維持較高的核糖體蛋白積累與植物抗旱性的提高密切相關(guān)[7]。擬南芥根系中的同源基因會(huì)編碼不同的核糖體蛋白[8]，核糖體蛋白的磷酸化等修飾作用會(huì)改變核糖體的蛋白合成活性，從而適應(yīng)環(huán)境脅迫[9]。

前人報(bào)道指出：斧形沙芥在重度干旱脅迫下，核糖體通路是差異基因富集的主要通路之一[10]。耐旱蠶豆中，50S核糖體蛋白在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其通過(guò)重建正常的蛋白質(zhì)構(gòu)象來(lái)保護(hù)植物免受干旱脅迫[11]。甘蔗核糖體蛋白基因也可在干旱脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)[12]。從茶樹(shù)抗旱性蛋白的鑒定中發(fā)現(xiàn)參與蛋白質(zhì)加工(核糖體蛋白)、清除活性氧和防御蛋白質(zhì)(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和硫氧還蛋白)上調(diào)可能會(huì)增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性[13]。核糖體蛋白是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵，在植物發(fā)育以及感知干旱脅迫等方面起著重要調(diào)節(jié)作用[14]。因此，植物核糖體代謝與干旱脅迫適應(yīng)具有明顯的相關(guān)性，但目前干旱脅迫下核糖體蛋白基因的表達(dá)及相應(yīng)調(diào)控機(jī)制研究較少，需深入研究和探討。

本研究采用高通量Illumina Hi Seq PE150測(cè)序平臺(tái)及生物信息學(xué)方法對(duì)發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，解析發(fā)菜吸水和干燥條件下的核糖體代謝差異表達(dá)基因變化規(guī)律，為發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

發(fā)菜(N.flagelliforme)樣品采自寧夏賀蘭山自然生長(zhǎng)地。將所采的發(fā)菜種植于模擬自然條件的培養(yǎng)床上，持續(xù)培養(yǎng)10 d后進(jìn)行樣品處理(溫度23～25 ℃、濕度30%、光周期12 h/12 h、光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1)。充分吸水4 h的發(fā)菜為對(duì)照組A，自然失水48 h的發(fā)菜為處理組B(圖1)。每種處理組設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

A.充分吸水4 h;B. 極度干燥48 h; 下同圖1 吸水和干燥條件下發(fā)菜的形態(tài)變化A. Hydration for 4 hours; B. Dehydration for 48 hours. The same as belowFig.1 Morphological changes of N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建發(fā)菜RNA的提取采用楊佳[15]優(yōu)化后的天根試劑盒法，得到樣品RNA后構(gòu)建cDNA測(cè)序文庫(kù)。使用Qubit 2.0初步定量文庫(kù)，稀釋至1 ng/μL的文庫(kù)的插入片段采用安捷倫2100進(jìn)行檢測(cè)。使用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)方法準(zhǔn)確定量插入片段符合預(yù)期的文庫(kù)的有效濃度(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L)，以確保其質(zhì)量達(dá)到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq測(cè)序及數(shù)據(jù)質(zhì)量控制原始數(shù)據(jù)(raw reads)是通過(guò)高通量Illumina HiSeq PE150測(cè)序平臺(tái)對(duì)已構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序所獲得。將原始數(shù)據(jù)中帶接頭(adapter)的讀段(reads)、無(wú)法確定堿基信息比例大于10%的讀段(reads)和低質(zhì)量讀段(reads)進(jìn)行過(guò)濾處理，獲得干凈讀段(clean reads)。然后以已公布的發(fā)菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)作為參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 差異基因篩選在基因列表中，以CorrectedP-value ≤ 0.05且|log2(FoldChange)|>0為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。

1.2.4 差異基因GO功能富集分析將篩選出的差異表達(dá)基因通過(guò)GO(Gene Ontology)進(jìn)行功能富集分析，確定差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)功能。

1.2.5 差異基因KEGG pathway分析將篩選出的差異表達(dá)基因通過(guò)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行Pathway顯著性富集分析來(lái)確定其參與的最主要的生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)，隨機(jī)選擇6個(gè)核糖體代謝差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)分析，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。選擇16S-rRNA為內(nèi)參基因，利用相對(duì)定量法進(jìn)行表達(dá)量估算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，數(shù)據(jù)方差分析和多重比較使用SPSS 17.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸水和干燥條件下發(fā)菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明，發(fā)菜總RNA樣品電泳顯示出明顯的23S和16S條帶(圖2)。使用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)的插入片段和核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定結(jié)果表明，發(fā)菜提取的總RNA符合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序送樣要求。

對(duì)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)中，錯(cuò)誤率≤0.03%，堿基G和C的含量占總堿基的45%左右，Q20和Q30均高于94%。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量具有較高的可靠性。

表1 qRT-PCR引物序列

以已公布的發(fā)菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)為參考基因組，對(duì)過(guò)濾后的測(cè)序序列通過(guò)Bowtie2進(jìn)行基因組定位分析。所有樣本測(cè)序序列(Total Mapped Reads or Fragments)定位的百分比高于78.23%，其中具有多個(gè)定位的測(cè)序序列(Multiple Mapped Reads or Fragments)占總體測(cè)序序列的值低于17.11%。為了確保測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)基因表達(dá)的準(zhǔn)確反映，需要對(duì)數(shù)據(jù)重復(fù)間的相關(guān)性進(jìn)行分析。對(duì)發(fā)菜兩個(gè)不同樣本進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果顯示，樣本間的相關(guān)系數(shù)均大于0.88(圖3)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)可靠、樣本間重復(fù)性良好且變異不大。

M. DNA marker;1-3. 發(fā)菜A;4-6. 發(fā)菜B圖2 發(fā)菜總RNA電泳結(jié)果M. DNA marker; 1-3. A of N. flagelliforme; 4-6. B of N. flagelliformeFig.2 Electrophoresis image of total RNA of N. flagelliforme

A1-A3. 充分吸水4 h;B1-B3. 極度干燥48 h圖3 樣品相關(guān)性檢測(cè)結(jié)果A1-A3. Hydration for 4 hours; B1-B3. Dehydration for 48 hoursFig.3 Sample correlation test results

2.2 吸水和干燥條件下發(fā)菜基因的差異表達(dá)

根據(jù)差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)2個(gè)樣品進(jìn)行兩兩差異基因統(tǒng)計(jì)分析，共篩選到差異表達(dá)基因3 383個(gè)。其中，與對(duì)照組相比，上調(diào)基因?yàn)? 767個(gè)，占總差異基因的52.2%；下調(diào)基因?yàn)? 616個(gè)，占總差異基因的47.8%(圖4)。

2.3 吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

對(duì)處理組中所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋富集分析(P≤0.05)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，涉及生物過(guò)程中的12個(gè)顯著富集的GO條目中，差異表達(dá)基因主要富集于有機(jī)氮化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、有機(jī)氮化合物生物合成、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝、酰胺生物合成、肽代謝、肽生物合成和翻譯等過(guò)程；細(xì)胞組分類別中的10個(gè)顯著富集的GO條目中，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞組分、膜組分、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)組分、核糖核蛋白復(fù)合體和核糖體等功能；參與分子功能的6個(gè)顯著富集的GO條目中，差異表達(dá)基因主要富集在核糖體的結(jié)構(gòu)組分、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和作用于tRNA的催化活性等功能。結(jié)果表明，在干燥條件下發(fā)菜基因主要富集在蛋白質(zhì)合成和代謝等相關(guān)代謝途徑中。

2.4 吸水和干燥條件下發(fā)菜核糖體代謝差異表達(dá)基因的KEGG Pathway富集分析

對(duì)處理組中所有差異表達(dá)基因通過(guò)KEGG pathway顯著性富集進(jìn)行分析，選取顯著富集到核糖體代謝途徑的代謝通路(P≤0.05)，發(fā)現(xiàn)均為上調(diào)表達(dá)的46個(gè)差異表達(dá)基因(表2)。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證核糖體代謝差異基因表達(dá)量

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)核糖體基因rplD、rplV、rplC、rplU、rpsB、rpsC在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在干燥條件下，基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著增加(P≤0.05)，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果一致(圖6)。

圖4 發(fā)菜差異表達(dá)基因火山圖Fig.4 Differential gene volcano plot of N. flagelliforme

* 表示顯著富集圖5 吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達(dá)基因GO富集圖* is significant enrichmentFig.5 GO enrichment of differential genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

圖6 吸水和干燥條件下發(fā)菜基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression of genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

3 討 論

本研究通過(guò)GO功能富集分析和KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，在吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達(dá)基因主要富集在蛋白質(zhì)合成與代謝等相關(guān)途徑，并且核糖體代謝途徑被顯著富集(P≤0.05)。核糖體代謝途徑包含了均為上調(diào)表達(dá)的46個(gè)差異基因。經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，干旱條件下的核糖體代謝途徑的差異表達(dá)基因的表達(dá)量顯著增加。

植物通過(guò)新陳代謝的變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境信號(hào)，蛋白質(zhì)合成便是其中之一[16]。核糖體是應(yīng)激條件下的基本亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，核糖體大亞基蛋白基因的上調(diào)可能會(huì)通過(guò)維持或改善核糖體的正常功能，從而維持蛋白質(zhì)的正常合成[17]。核糖體蛋白是核糖體生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成中不可或缺的物質(zhì)。小麥的蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，核糖體蛋白在干旱條件下會(huì)發(fā)生顯著變化[18]。核糖體是一種復(fù)雜的負(fù)責(zé)合成多肽的核糖核蛋白復(fù)合體，含有大量的核糖體蛋白質(zhì)組分，這些核糖體蛋白的合成協(xié)調(diào)對(duì)植物細(xì)胞應(yīng)對(duì)干旱脅迫構(gòu)成了重大的挑戰(zhàn)，其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物核糖體蛋白基因調(diào)控的重要組成部分[19]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白L4、L22輔助RNA形成多肽出口通道，且多肽出口通道主要由大亞基核糖體蛋白L19、L22、L23、L24、L31e組成，以上核糖體蛋白具有分泌和參與折疊新生蛋白的功能[20]。此外，有研究指出擬南芥種子萌發(fā)和幼苗早期對(duì)滲透脅迫和脫落酸的靈敏性可通過(guò)核糖體蛋白L24A調(diào)節(jié)擬南芥鋅指結(jié)構(gòu)(atrzf1)突變體中的脯氨酸含量來(lái)改變[21]。核糖體蛋白L5是一個(gè)穿梭蛋白，在 5S rRNA核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起作用[22]。干旱、鹽和凍害脅迫對(duì)核糖體L5基因表達(dá)有一定的誘導(dǎo)作用[23]。蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中核糖體蛋白L10、L11、L7/L12具有招募蛋白因子和激活GTP酶的作用[24]。UV-B輻射應(yīng)激信號(hào)可能通過(guò)CKB1調(diào)控核糖體L10家族的表達(dá)來(lái)積極調(diào)節(jié)[25]。核糖體蛋白L44基因在煙草中過(guò)表達(dá)會(huì)提高對(duì)干旱脅迫的耐受性[26]。植物核糖體蛋白基因的表達(dá)在各種脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了變化，如擬南芥的核糖體蛋白L23a[27]、煙草L3[28]等。本研究發(fā)現(xiàn)以上這些核糖體蛋白的相關(guān)基因在發(fā)菜干燥條件下都上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這些基因和發(fā)菜的耐旱性關(guān)系密切。

表2 吸水和干燥條件下發(fā)菜參與核糖體代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)基因

續(xù)表2 Continued Table 2

核糖體蛋白S21、S8、S2、S11和S7可作為解旋酶幫助聚合到原核生物核糖體上的mRNA解旋，調(diào)控肽鏈的合成[29]。有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中核糖體蛋白S10在小亞基中具有非常重要的作用，缺失S10直接導(dǎo)致具有功能的核糖體數(shù)量減少[30]。細(xì)菌核糖體蛋白S1接近肽鏈合成通道附近，可以與核糖體蛋白S2、S3、S5、S6、S18等核糖體蛋白互作[31]。核糖體蛋白S6的修飾參與了擬南芥發(fā)育調(diào)節(jié)和對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)性，S6是翻譯效率和核糖體生物發(fā)生水平上的一個(gè)關(guān)鍵的蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子[32]。擬南芥中的核糖體蛋白S21突變損害光合作用和葉綠體發(fā)育，并且對(duì)葡萄糖高度敏感[33]。比較蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S5影響了光系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ蛋白以及質(zhì)體核糖體蛋白的大量積累，而且葉綠體核糖體蛋白S5和PSRP2影響干旱脅迫中種子的萌發(fā)以及鹽脅迫中種子的生長(zhǎng)[34-35]。此外，植物還可以通過(guò)高度動(dòng)態(tài)的翻譯機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)干旱脅迫，這種機(jī)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制協(xié)同作用[36]。以上研究結(jié)果說(shuō)明核糖體蛋白可以適當(dāng)調(diào)控植物應(yīng)對(duì)外界脅迫。在本研究中這些核糖體蛋白的相關(guān)基因在發(fā)菜干燥條件下也呈上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明這些基因的表達(dá)可能參與了發(fā)菜適應(yīng)外界環(huán)境變化的調(diào)節(jié)。

因此，我們認(rèn)為發(fā)菜在干燥條件下可能通過(guò)激活特定的基因來(lái)維持核糖體組分的完整性，有助于核糖體重構(gòu)和選擇性翻譯，從而幫助抗旱相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成和正確折疊、并參與滲透調(diào)節(jié)作用等重要生理活動(dòng)進(jìn)而調(diào)控其對(duì)干燥環(huán)境條件的適應(yīng)。