王炳宇，楊宇馳，許立偉，薛桂新

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是世界第一大水果，由于其特殊的顏色、香氣和高營養(yǎng)價值而受到消費者的喜愛[1]。我國柑橘產(chǎn)量大，柑橘收獲期集中，易造成堆積腐爛的現(xiàn)象，且我國柑橘加工行業(yè)薄弱，加工產(chǎn)品種類少，綜合利用價值低[2]。柑橘因含水量較高，除了加工成果汁，還適宜加工果醋。柑橘加工成果醋不僅能去除本身含有的檸檬苦素，提高醋的品質(zhì)，還能緩解滯銷，降低經(jīng)濟損失[3-5]。

果醋中揮發(fā)性物質(zhì)主要有酸類、酯類、醇類、醛類等，這些物質(zhì)決定著果醋的風(fēng)味成分[6]。目前，學(xué)者們對不同種類果醋揮發(fā)性成分的種類和含量進(jìn)行了研究[7-9]，對果醋發(fā)酵條件優(yōu)化、菌種優(yōu)化[10-11]也有一些報道。韋璐等[12]通過頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測香蕉果醋中的揮發(fā)性物質(zhì)，共檢測出79種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中乙酸和酯類物質(zhì)含量最高；卜智斌等[13]利用液-液萃取和氣相色譜-質(zhì)譜法比較了駿棗果醋發(fā)酵后風(fēng)味物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)駿棗果醋果醋的酯類物質(zhì)和酸類物質(zhì)相對含量最高；高鵬巖等[14]先對蘋果醋的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，然后利用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對果醋的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測。發(fā)酵基質(zhì)不同對果醋揮發(fā)性成分的影響也很大，但至今報道得很少。

本研究利用電子鼻和頂空-固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（heaspace solidphase micro extraction gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對不同發(fā)酵基質(zhì)的柑橘果醋揮發(fā)性成分進(jìn)行分析測定，目的在于一方面了解柑橘果醋與其他果醋揮發(fā)性成分在種類和含量的差異，另一方面比較柑橘果醋四種不同發(fā)酵基質(zhì)揮發(fā)性成分的差異，為柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)的選擇和提高柑橘果醋風(fēng)味品質(zhì)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司；滬釀1.01醋酸菌為巴氏醋桿菌巴氏亞種（Acetobacter pasteurianussubsp.pasteurianus）：上海釀造科學(xué)研究所；白砂糖（食品級）：廣東大華糖業(yè)有限公司；95%食用酒精：牡丹江白酒廠；果膠酶（酶活30 000 U/g）：德國三顆星食品公司；2-甲基-3-庚酮（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴（色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA10003N分析天平：民橋精密科學(xué)儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH.S電熱恒溫水浴鍋：江蘇省醫(yī)療機械廠；TDZ5-WS高速離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；PEN3型電子鼻：德國AIRSENSE公司；7890B-5977B氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；50/30μmDVB/CARonPDMS萃取頭、HS-SPME頂空固相微萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柑橘果醋發(fā)酵工藝流程及操作要點

操作要點：

柑橘：選擇無霉?fàn)€、成熟適度的果實。

去皮、榨汁、過濾：柑橘去皮后將果肉榨汁，用120目濾布過濾。

調(diào)糖：在柑橘果汁中添加白砂糖，調(diào)整糖度為20°Bx。

活化酵母菌：35～38 ℃無菌蒸餾水中加入10%干酵母和0.2%白砂糖，充分?jǐn)嚢瑁_保酵母完全溶解，蓋上保鮮膜在35～38 ℃條件下水浴活化20～30 min。

酒精發(fā)酵：在無菌條件下，柑橘果汁中加入0.02%活化后的酵母，然后室溫（20～24 ℃）條件下密封發(fā)酵至醋酸發(fā)酵所需要的酒精度。

醋母培養(yǎng)：無菌環(huán)境中將醋酸菌接入醋酸菌活化培養(yǎng)基，在30℃條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)至醋酸菌菌落數(shù)＞108CFU/mL。

醋酸發(fā)酵：按10%（V/V）的接種量將醋酸菌液接種至酒精度為6%vol的柑橘果酒中，32 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔12 h取樣測定總酸含量，至兩次測定結(jié)果不再增加時結(jié)束發(fā)酵。

柑橘果醋殺菌：70 ℃條件下殺菌30 min。

貯存：在無菌的條件下進(jìn)行灌裝，常溫下貯存，即得成品。

1.3.2 四種不同發(fā)酵基質(zhì)的組成及其制備

柑橘果醋四種不同發(fā)酵基質(zhì)的組成及其制備方法見表1。

表1 不同果醋的實驗設(shè)計Table 1 Experimental design of different fruit vinegar

1.3.3 四種不同發(fā)酵基質(zhì)的柑橘果醋嗅覺成分測定方法

柑橘果醋嗅覺成分測定以柑橘果汁（citrus juice，CJ）和柑橘果酒（citrus wine，CW）為參比，參考董畫等[15]的方法，改動如下：傳感器清洗時間為260 s，檢測時間為100 s。對四種柑橘果醋的嗅覺成分進(jìn)行測定，電子鼻傳感器名稱及所對應(yīng)的嗅覺成分如表2所示。

表2 電子鼻傳感器名稱及所對應(yīng)的嗅覺成分Table 2 Name of the electronic nose sensor and the corresponding olfactory components

續(xù)表

1.3.4 四種柑橘果醋HS-SPME-GC-MS測定方法

HS-SPME條件：取0.5 mL柑橘果醋樣品于頂空瓶中，50℃條件下以250r/min攪拌15min，然后在50℃下用50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取頭萃取30 min。

GC-MS條件：DB-wax毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣溫度為260 ℃；程序升溫為40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；不分流進(jìn)樣。載氣：高純氦氣（He）；流量：1 mL/min。

接口溫度和離子源溫度分別為260 ℃和230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍20～400 m/z[16]。

本實驗對檢測結(jié)果根據(jù)匹配度、保留指數(shù)（retention index，RI）進(jìn)行定性；采用2-甲基-3-庚酮進(jìn)行半定量計算揮發(fā)性物質(zhì)的濃度，計算公式如下：

式中：X為揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/L；A為揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積；C為2-甲基-3-庚酮的質(zhì)量濃度，μg/L；A0為2-甲基-3-庚酮的峰面積。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

四種柑橘果醋揮發(fā)性成分的相關(guān)數(shù)據(jù)通過Excel2019和SPSS21軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種不同發(fā)酵基質(zhì)的柑橘果醋主成分分析

柑橘果汁、柑橘果酒和四種柑橘果醋的電子鼻主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，PC1和PC2方差累計貢獻(xiàn)率為99.49%，保留了幾乎所有的原始信息。柑橘果汁、柑橘果酒和柑橘果醋在PC1和PC2上均能很好的區(qū)分開，四種柑橘果醋也能很好的分開。EACV在PC1軸與柑橘果汁的距離較近，說明EACV比其他三種柑橘果醋更相近于柑橘果汁的氣味。WJCV和WWCV在PC1軸與果酒氣味更接近，WVCV氣味介于EACV和WJCV、WWCV之間。樣品在PC2軸距離較近，差異不大，說明樣品嗅覺成分差異主要體現(xiàn)在第一主成分上。

圖1 四種柑橘果醋電子鼻主成分分析圖Fig.1 PCA diagram of four citrus fruit vinegar electronic nose

通過SPSS對電子鼻傳感器響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得到主成分表達(dá)式：第一主成分=0.918X1+0.891X2+0.905X3-0.553X4+0.870X5+0.945X6+0.723X7+0.901X8+0.715X9-0.690X10；第二主成分=0.375X1-0.068X2+0.416X3+0.734X4+0.488X5+0.319X6-0.620X7+0.434X8-0.668X9+0.647X10，由第一主成分公式可知，W1C、W3C、W1S和W2S四個傳感器對第一主成分方差貢獻(xiàn)率較大，結(jié)合表1可以看出，四種柑橘果醋的芳香類、氮氧化合物、氨類芳香成分、烷烴類芳香成分、甲烷和醇類對柑橘果醋的嗅覺成分貢獻(xiàn)率較大。

2.2 四種不同發(fā)酵基質(zhì)柑橘果醋揮發(fā)性成分種類和含量分析

四種柑橘果醋的主要揮發(fā)性成分結(jié)果見表3。由表3可知，四種柑橘果醋中共檢測出138種揮發(fā)性成分，包括酯類物質(zhì)34種、醇類物質(zhì)37種、酸類物質(zhì)20種、醛類物質(zhì)8種、酚酮類物質(zhì)13種、烴類物質(zhì)10種和其他類物質(zhì)16種。EACV檢出揮發(fā)性物質(zhì)52種，質(zhì)量濃度為23 429.75 μg/L；WVCV檢出85種，質(zhì)量濃度為64 609.52 μg/L；WJCV檢出66種，質(zhì)量濃度為29 117.97 μg/L；WWCV檢出60種，質(zhì)量濃度為39 012.34 μg/L。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度高低順序依次為：WVCV＞W(wǎng)WCV＞W(wǎng)JCV＞EACV，這說明不同發(fā)酵基質(zhì)果醋其揮發(fā)性成分種類和質(zhì)量濃度均不同。

表3 四種柑橘果醋的揮發(fā)性成分Table 3 Volatile components of four citrus fruit vinegars

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.2.1 四種柑橘果醋中酸類化合物分析

由圖2和表3可知，四種柑橘果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中酸類化合物均含量最高，是決定果醋風(fēng)味的重要化合物。EACV、WVCV、WJCV、WWCV酸類物質(zhì)分別檢出7種、15種、8種、10種酸類化合物，質(zhì)量濃度分別為20 209.29 μg/L、23 522.00 μg/L、17 753.25 μg/L、22 891.08 μg/L。四種柑橘果醋酸類物質(zhì)濃度高低依次為WVCV＞W(wǎng)WCV＞EACV＞W(wǎng)JCV。由此可見，四種柑橘果醋的酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度占比較大，對果醋風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

圖2 四種柑橘果醋中揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度Fig.2 Mass concentration of volatile components in four citrus fruit vinegars

2.2.2 四種柑橘果醋中醇類化合物分析

果醋中的醇類物質(zhì)一部分來自于自身的發(fā)酵基質(zhì)，另一部分則是醋酸菌在發(fā)酵過程中微生物代謝水解產(chǎn)生的，豐富了果醋的味道[10]。由圖2和表3可知，EACV、WVCV、WJCV、WWCV醇類物質(zhì)分別檢出15種、24種、20種、14種，質(zhì)量濃度分別為352.69 μg/L、2 326.76 μg/L、1 574.78 μg/L、2 290.54 μg/L，四種柑橘果醋醇類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WVCV＞W(wǎng)WCV＞W(wǎng)JCV＞EACV。由此可見，WVCV、WJCV和WWCV中的醇類物質(zhì)種類和質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于EACV，醇香風(fēng)味更加豐厚。

2.2.3 四種柑橘果醋中酯類化合物的分析

酯類物質(zhì)是乙酰輔酶A與氨基酸反應(yīng)生成的高級醇的反應(yīng)產(chǎn)物，是果醋中的特殊性香氣成分[29]。由圖2和表3可知，EACV酯類物質(zhì)檢出10種，質(zhì)量濃度為102.79 μg/L；WVCV酯類物質(zhì)檢出15種，質(zhì)量濃度為856.30 μg/L；WJCV酯類物質(zhì)檢出19種，質(zhì)量濃度為1 629.97 μg/L；WWCV酯類物質(zhì)檢出17種，質(zhì)量濃度為2 860.40 μg/L，四種柑橘果醋酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WWCV＞W(wǎng)JCV＞W(wǎng)VCV＞EACV。由此可見，EACV中醇類物質(zhì)種類和質(zhì)量濃度均低于WVCV、WJCV和WWCV，這說明EACV的酯類風(fēng)味不如其他三種柑橘果醋豐富濃厚。

2.2.4 四種柑橘果醋中醛類化合物的分析

由圖2和表3可知，EACV醛類物質(zhì)檢出4種，質(zhì)量濃度為703.61 μg/L；WVCV醛類物質(zhì)檢出6種，質(zhì)量濃度為1144.69μg/L；WJCV醛類物質(zhì)檢出4種，質(zhì)量濃度為70.48μg/L；WWCV醛類物質(zhì)檢出3種，質(zhì)量濃度為1 415.91 μg/L，四種柑橘果醋醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WWCV＞W(wǎng)VCV＞EACV＞W(wǎng)JCV。四種柑橘果醋中檢測出的醛類物質(zhì)的種類及質(zhì)量濃度均較少。

2.2.5 四種柑橘果醋中酚酮類、烴類及其他類化合物的分析

由表3可知，四種柑橘果醋酚酮類物質(zhì)分別檢出4、11、7和8種，其中EACV的酚酮類物質(zhì)含量及種類低于其他三種柑橘果醋，且WVCV、WJCV和WWCV中酚酮類化合物含量及種類均有所不同，WVCV的酚酮類化合物種類及含量最高，揮發(fā)性風(fēng)味更加豐富。

烴類及其他類物質(zhì)多數(shù)是醋酸菌代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，少數(shù)為原料本身的化合物，幾乎都屬于單鏈烷烴無味或帶有刺激性氣味對柑橘果醋醋體影響不大[30]。

3 討論

實驗結(jié)果表明，不同的發(fā)酵基質(zhì)對柑橘果醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量具有較大的差異，其差異的原因是否與其他因素有關(guān)，還有待于后續(xù)的研究。

其次，WVCV、WJCV和WWCV的揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量均高于EACV，而前者三種果醋均具有酵母發(fā)酵的過程，酵母發(fā)酵階段可能會增加一些芳香類物質(zhì)，如醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)等，使果醋揮發(fā)性風(fēng)味更加豐富。

四種不同發(fā)酵基質(zhì)的柑橘果醋其風(fēng)味也各不相同，實驗結(jié)果表明，EACV雖然揮發(fā)性成分的種類及含量不及其他三種柑橘果醋，但是其氣味與柑橘果汁更為接近，其他三種柑橘果醋只有正常果醋的酸味而鮮有柑橘果汁的氣味。

4 結(jié)論

四種柑橘果醋中共檢測出138種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、醇類、酸類、醛類、酚酮類、烴類和其他類物質(zhì)；發(fā)酵基質(zhì)不同的四種柑橘果醋總揮發(fā)性成分種類和質(zhì)量濃度均不同，其質(zhì)量濃度高低順序依次為：WVCV＞W(wǎng)WCV＞W(wǎng)JCV＞EACV。

四種發(fā)酵基質(zhì)不同的柑橘果醋其酸類、醇類、酯類、醛類、酚類、酮類、烴類和其他類物質(zhì)種類和質(zhì)量濃度也不同，酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度占比較大，對果醋風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。其中，酸類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WVCV＞W(wǎng)WCV＞EACV＞W(wǎng)JCV；醇類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WVCV＞W(wǎng)WCV＞W(wǎng)JCV＞EACV；酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WWCV＞W(wǎng)JCV＞W(wǎng)VCV＞EACV；醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度高低依次為WWCV＞W(wǎng)VCV＞EACV＞W(wǎng)JCV；酚、酮類、烴類及其他類化合物質(zhì)量濃度也不同。