張茜茜　劉文德　李智強(qiáng)

中圖分類號(hào)： S435.111.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020118

水稻是最重要的糧食作物之一，供養(yǎng)著全世界50%以上的人口。然而，由稻瘟病菌引起的水稻全生育期病害極其嚴(yán)重且難以控制。研究顯示，稻瘟病造成的水稻年均減產(chǎn)量可大約供給6000萬(wàn)人口的稻米需求。稻瘟病菌無(wú)性態(tài)為灰梨孢犘狔狉犻犮狌犾犪狉犻犪狅狉狔狕犪犲Sacc，屬半知菌亞門(mén)，叢梗孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，梨形孢屬;有性態(tài)為犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲狅狉狔狕犪犲BarrYaegash，子囊菌亞門(mén)。其侵染階段分為：首先，在適宜溫濕度條件下，稻瘟病菌分生孢子梗產(chǎn)生分生孢子，作為侵染循環(huán)的接種體;其次，借助空氣和風(fēng)雨的傳播，分生孢子利用尖端的黏液附著在植物組織表面，2h后萌發(fā)形成芽管，8h后特異性分化產(chǎn)生附著胞;成熟的附著胞隨即形成侵染釘穿透植物表皮細(xì)胞，侵入植物體內(nèi);最后，稻瘟病菌菌絲在寄主細(xì)胞內(nèi)和組織間生長(zhǎng)，并在侵染4～5d后形成病斑，寄主細(xì)胞死亡。空氣濕度較高的情況下，稻瘟病菌侵染菌絲再次產(chǎn)生分生孢子梗和分生孢子，形成新一輪侵染循環(huán)，造成病害的不斷產(chǎn)生與擴(kuò)散。自稻瘟病菌全基因組測(cè)序完成以來(lái)，己有上百個(gè)基因被預(yù)測(cè)并證明可能與稻瘟病菌的致病性相關(guān)。如敲除稻瘟病菌MoDuol基因后，發(fā)現(xiàn)其突變體分生孢子發(fā)育異常，營(yíng)養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)減緩，致病力明顯減弱。有些基因則與稻瘟病菌附著胞和侵染釘?shù)男纬捎嘘P(guān)，如Pmk1、MoMSB2、MoSHO1、Com1等，進(jìn)而影響其致病性。因此，稻瘟病菌致病相關(guān)基因及其與水稻的互作研究是尋找新的防病途徑的關(guān)鍵，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。

為了順利侵入寄主植物，病原菌需要經(jīng)歷一系列形態(tài)和生理變化，其中包括抑制或克服植物免疫系統(tǒng)，擾亂寄主新陳代謝和信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)其自身生長(zhǎng)。相應(yīng)地，植物體內(nèi)進(jìn)化出一套相對(duì)完善的防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括兩個(gè)層面。第一是植物細(xì)胞表面模式識(shí)別受體識(shí)別保守的病原菌相關(guān)分子模式（PAMP）激發(fā)植物基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)PTI（PAMPtriggeredimmunity）;第二是植物抗病蛋白直接或間接識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)蛋白產(chǎn)生的更強(qiáng)烈的免疫防衛(wèi)反應(yīng)ETI（Effectortriggeredimmunity），通常在侵染位點(diǎn)引起寄主細(xì)胞死亡。在植物和病原菌激烈的“軍備競(jìng)賽”中，PTI是寄主植物先天免疫的基礎(chǔ)防線。寄主植物模式識(shí)別受體識(shí)別到鞭毛蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)和小分子等病原菌相關(guān)分子模式即可抵御病原菌侵染。隨之病原菌協(xié)同進(jìn)化出多種途徑直接或間接抑制植物PTI反應(yīng)，其中最重要的是通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白干擾免疫反應(yīng)。大多數(shù)真菌效應(yīng)蛋白N端具有信號(hào)肽，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體蛋白分泌系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，或被轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞特定空間發(fā)揮作用?；蚪M、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等相關(guān)生物技術(shù)的不斷發(fā)展，使越來(lái)越多與水稻互作的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白先后被鑒定。稻瘟病菌Slp1基因編碼一個(gè)具有分泌功能的LysM 效應(yīng)蛋白，通過(guò)與水稻模式識(shí)別受體幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白（CEBIP）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合幾丁質(zhì)，抑制植物免疫反應(yīng)。AVRPITA 和PWL2含有分泌信號(hào)肽且在真菌侵入、定殖和晚期感染過(guò)程中特異表達(dá)。犪犮犲1是已克隆無(wú)毒基因中唯一編碼非分泌蛋白的基因，控制合成一種次生代謝物，侵染水稻時(shí)特異性積累在附著胞細(xì)胞質(zhì)中。

鑒定更多的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白并明確其在寄主細(xì)胞中的可能作用位置及其致病性不僅是當(dāng)前研究“水稻稻瘟病菌”分子互作機(jī)制的熱點(diǎn)內(nèi)容，而且對(duì)稻瘟病防治及培育抗性品種等工作具有極其重要的意義。前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用RLSAGE、MPSS與SBS轉(zhuǎn)錄組高通量分析技術(shù)，檢測(cè)到MoIeep1分泌蛋白基因在稻瘟病菌侵染寄主植物時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。為進(jìn)一步了解該基因的功能，本文對(duì)MoIEEP1（MGG_00083）蛋白的預(yù)測(cè)信號(hào)肽進(jìn)行了分析與功能驗(yàn)證，亞細(xì)胞定位分析與驗(yàn)證了該蛋白的定位，并構(gòu)建該基因的敲除突變體，解析其生長(zhǎng)表型與致病性，為進(jìn)一步研究該效應(yīng)蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料水稻品種為‘日本晴和‘CO39。稻瘟病菌菌株為Guy11，農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株為EHA105，克隆菌株為大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α和JM109，酵母突變體菌株為YTK12。試驗(yàn)用載體為用于信號(hào)肽驗(yàn)證的pSUC2和用于水稻亞細(xì)胞定位的pYBA1132，以上試驗(yàn)材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于酵母菌培養(yǎng)的SD/T培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 效應(yīng)蛋白基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù)真菌數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∥fungidb.org/fungidb/）中MoIeep1（GeneID：MGG_00083）基因編碼區(qū)（CDS）序列信息，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)包含全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（fulllength，F(xiàn)L）和不含預(yù)測(cè)信號(hào)肽的截短編碼區(qū)（nosignalpeptide，NS）目的基因引物，正反向引物前端加上合適的酶切位點(diǎn)及同源序列，用于載體構(gòu)建;以稻瘟病菌菌株Guy11菌絲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因并進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)和純化回收;對(duì)pSUC2和pYBA1132載體相應(yīng)酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，膠回收后分別與MoIeep1基因不同片段重組連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取適量單克隆菌落進(jìn)行PCR 篩選和測(cè)序驗(yàn)證;確認(rèn)序列準(zhǔn)確的單菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆?。引物合成和測(cè)序由北京擎科生物技術(shù)公司完成。

1.2.2 效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)錄分析

參照吳立葉等的稻瘟病菌菌絲和孢子樣品收集方法，獲得Guy11新鮮菌絲和孢子樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?。噴霧接種法將Guy11分生孢子接種于生長(zhǎng)1周的大麥葉片背面，分別在接種后2h（芽管形成階段）、8h（附著胞形成階段）、18、24、42h撕取葉片下表皮，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TRIzol法提取稻瘟病菌Guy11菌絲、孢子及不同侵染時(shí)期大麥樣品總RNA，獲得的總RNA 用全式金生物公司RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 作為熒光定量PCR（qRTPCR）模板。本試驗(yàn)使用引物見(jiàn)表1。內(nèi)參基因MoActin（MGG_03982）作為對(duì)照，基因表達(dá)量用相對(duì)閾值法（2^-ΔΔCT）計(jì)算，軟件GraphPadPrism5分析并作圖。

1.2.3 效應(yīng)蛋白生物信息學(xué)分析

利用SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP5.0/）在線平臺(tái)預(yù)測(cè)MoIEEP1氨基酸序列信號(hào)肽的有無(wú)和具體位置;WoLFPSORT（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）在線平臺(tái)預(yù)測(cè)MoIEEP1在植物中的亞細(xì)胞定位。網(wǎng)站預(yù)測(cè)過(guò)程中，均需首先輸入MoI

EEP1氨基酸序列Fasta格式，信號(hào)肽分析選擇“Organismgroup”為“Eukarya”，亞細(xì)胞定位分析選擇相應(yīng)物種類型為“Plant”，然后直接提交即可獲得預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.4 效應(yīng)蛋白信號(hào)肽驗(yàn)證

LiAc法制備酵母突變體菌株YTK12感受態(tài)細(xì)胞，并將構(gòu)建好的含有目的基因MoIeep1的pSUC2載體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取轉(zhuǎn)化成功的酵母單克隆于SD/T液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.8時(shí)，菌液稀釋1000倍劃線于蔗糖篩選培養(yǎng)基上，觀察酵母菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 效應(yīng)蛋白亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

高滲透壓下，利用以纖維素酶和果膠酶為主要成分配制的酶解液消化生長(zhǎng)10d的‘日本晴水稻黃化苗細(xì)胞壁，使之結(jié)構(gòu)松散破壞;隨后移除酶解液，用普通滲透壓，濃度為0.6mol/L的緩沖液使細(xì)胞吸水，原生質(zhì)體沖破細(xì)胞壁釋放出來(lái)，離心收集原生質(zhì)體。再將構(gòu)建好的含有目的基因MoIeep1的pYBA1132載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中，光照培養(yǎng)箱28℃，L∥D=12h∥12h條件下孵育48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6 MoIeep1基因敲除突變體的構(gòu)建

依據(jù)改進(jìn)的SplitPCR方法進(jìn)行目的基因敲除。首先根據(jù)稻瘟病菌犕狅犐犲犲狆1基因組DNA 序列信息，設(shè)計(jì)兩輪PCR 擴(kuò)增引物;然后以稻瘟病菌Guy11基因組DNA 為模板，LBCK/LBR和RBF/RBCK兩對(duì)引物，分別擴(kuò)增目的基因上游LB 片段和下游RB片段，并以pCX62載體為模板，HYGF/HYGR擴(kuò)增完整潮霉素（HYG）基因;再分別以片段LB和HYG共同作為模板，LBF和HYGR1為引物，擴(kuò)增出片段LB+HY，以片段RB和HYG 共同作為模板，HYGF1和RBR為引物，擴(kuò)增出片段YG+RB;最后將兩個(gè)DNA 融合片段共同轉(zhuǎn)化至稻瘟病菌Guy11原生質(zhì)體;用含有潮霉素抗性的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行DNA 和RNA 水平的驗(yàn)證，最終獲得陽(yáng)性敲除菌株。

1.2.7 MoIeep1突變體生長(zhǎng)表型分析

用孔徑6mm 打孔器從生長(zhǎng)一周左右的稻瘟病菌野生型菌株Guy11和2個(gè)MoIeep1敲除突變體菌落邊緣取同等大小的菌塊，同時(shí)接種于完全培養(yǎng)基（CM）正中央，28℃黑暗培養(yǎng)7d后觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)并測(cè)量菌落直徑。

1.2.8 MoIeep1突變體致病力檢測(cè)

稻瘟病菌野生型菌株Guy11和突變體菌株于25℃養(yǎng)菌室暗培養(yǎng)3d后恢復(fù)光照，7～10d后產(chǎn)生大量孢子。用0.05%的Tween20水溶液洗下分生孢子，并調(diào)整孢子懸浮液濃度為1.5×10⁵個(gè)/mL，再均勻噴施在三葉一心期‘CO39水稻葉片上，避免孢子懸浮液液滴凝聚，影響接種效果。接種后于植物光照培養(yǎng)箱中26～28℃，覆膜黑暗保濕培養(yǎng)24h，然后恢復(fù)正常光照，溫度不變，光照和黑暗各12h，濕度為80%～90%，7d后調(diào)查病情并統(tǒng)計(jì)病斑密度。即統(tǒng)計(jì)葉片上一定面積的病斑數(shù)，計(jì)算不同病原菌接種后的平均病斑數(shù)（個(gè)/cm²）。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因MoIeep1轉(zhuǎn)錄分析

稻瘟病菌侵染水稻過(guò)程中，黏附在水稻表面的分生孢子先產(chǎn)生芽管，再逐漸分化出一種特殊的圓頂狀休眠結(jié)構(gòu)———附著胞，附著胞通過(guò)積累高濃度的相容性溶質(zhì)產(chǎn)生巨大的膨壓，細(xì)胞膨壓再轉(zhuǎn)換成機(jī)械動(dòng)力，促使侵染釘穿透葉角質(zhì)和表皮細(xì)胞壁。稻瘟病菌侵染早期表達(dá)的效應(yīng)蛋白更有可能與致病性相關(guān)。我們利用qRTPCR 技術(shù)，驗(yàn)證了稻瘟病菌MoIeep1 在不同生長(zhǎng)和侵染時(shí)期的表達(dá)水平。如圖1所示，MoIeep1在侵染初期8h（附著胞形成階段）表達(dá)量最高，而在菌絲、孢子等營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)量較低，侵染寄主8h后的表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)。推測(cè)該基因可能在稻瘟病菌被寄主植物識(shí)別或進(jìn)行活體營(yíng)養(yǎng)侵染階段發(fā)揮重要作用。

2.2 稻瘟病菌效應(yīng)蛋白犕MoIEEP1信號(hào)肽分析與驗(yàn)證

信號(hào)肽是真菌效應(yīng)蛋白N端的一段氨基酸序列，使效應(yīng)蛋白在病原菌入侵寄主植物時(shí)具有分泌性。首先利用SignalP在線分析軟件預(yù)測(cè)了MoIEEP1蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果表明，該蛋白N端氨基酸序列具有信號(hào)肽，且其信號(hào)肽切割位點(diǎn)為17/18（圖2）。隨后構(gòu)建了2個(gè)MoIeep1基因的pSUC2（含蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因）轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化到酵母突變體菌株YTK12中。YTK12菌株不含蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因，僅能在YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而不能在以蔗糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），轉(zhuǎn)化Avr1b_pSUC2（陽(yáng)性對(duì)照）的YTK12菌株能在蔗糖篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但含有mg87_pSUC2（陰性對(duì)照）的YTK12菌株因mg87不具有分泌性，不能在蔗糖篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。含MoIEEP1_FL_pSUC2序列的菌株能在蔗糖篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而含MoIEEP1_NS_pSUC2序列的菌株不能在蔗糖篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明該效應(yīng)蛋白含有信號(hào)肽序列，為分泌蛋白。

2.3稻瘟病菌效應(yīng)蛋白犕狅犐犈犈犘1亞細(xì)胞定位分析與驗(yàn)證

病原菌效應(yīng)蛋白在水稻細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。采用WoLFPSORT軟件對(duì)MoIEEP1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。該軟件數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于UniProt網(wǎng)站，分為真菌、植物和動(dòng)物3個(gè)方面，各包含2113、2333和12771個(gè)蛋白質(zhì)?；诜诸愋盘?hào)、氨基酸組成和功能修飾（如DNA結(jié)合基序），WoLFPSORT將蛋白質(zhì)氨基酸序列轉(zhuǎn)換為數(shù)字定位特征，然后使用k近鄰分類法預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位。預(yù)測(cè)結(jié)果以兩種方式顯示：Ⅰ）與查詢序列最相似定位特征的已知定位蛋白質(zhì)個(gè)數(shù);Ⅱ）關(guān)于各個(gè)已知定位蛋白的詳細(xì)特征信息。如表2、表3所示，該軟件共篩選到14個(gè)MoIEEP1最相似定位蛋白。其中與定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜、過(guò)氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中的相似蛋白質(zhì)個(gè)數(shù)相等且最多;其次是葉綠體和細(xì)胞外基質(zhì)。所以MoIEEP1蛋白極有可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器。激光共聚焦觀察亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：MoIEEP1蛋白質(zhì)全長(zhǎng)或去信號(hào)肽均在水稻原生質(zhì)體中呈明亮點(diǎn)狀的定位信號(hào)，排除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，初步推測(cè)該定位信號(hào)為過(guò)氧化物酶體或線粒體等細(xì)胞器（圖4）。該結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)內(nèi)容相互輔正，可信度較高。

2.4 MoIeep1基因敲除突變體的獲得

本研究利用SplitPCR方法構(gòu)建MoIeep1基因敲除突變體。通過(guò)兩輪PCR 擴(kuò)增待敲除基因兩側(cè)的同源片段分別融合部分潮霉素基因，再將兩個(gè)DNA片段直接轉(zhuǎn)化至稻瘟病菌Guy11原生質(zhì)體，兩個(gè)片段經(jīng)過(guò)同源重組構(gòu)成完整的潮霉素基因，進(jìn)而替換目的基因，獲得陽(yáng)性敲除菌株（圖5a）。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程操作方便，轉(zhuǎn)化效率高。潮霉素抗性培養(yǎng)基上篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，需分別提取菌絲DNA 和RNA進(jìn)一步驗(yàn)證。DNA水平上，目的基因內(nèi)部引物MoIEEP1NF/NR和基因上下游1.5kb處的正反向引物UA/DB 與潮霉素基因的正反向引物H708/H853同時(shí)驗(yàn)證（圖5b）;RNA水平上，僅用基因內(nèi)部正反向引物鑒定即可（圖5c）。結(jié)果如圖所示。本試驗(yàn)成功獲得2個(gè)目的基因敲除突變體，后續(xù)試驗(yàn)中分別命名為MoIEEP1KO1、MoIEEP1KO2。

2.5 MoIeep1敲除突變體表型鑒定

生長(zhǎng)表型方面，稻瘟病菌野生型菌株Guy11和MoIeep1敲除突變體在CM 培養(yǎng)基生長(zhǎng)一周的表型如圖6所示，突變體和野生型在菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速率方面無(wú)明顯差異，和圖7中菌落生長(zhǎng)直徑測(cè)量結(jié)果一致，表明MoIeep1基因可能不直接參與稻瘟病菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程;致病性方面，水稻葉片發(fā)病情況和病斑密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9，相比于野生型菌株，MoIeep1敲除突變體致病性輕微減弱。因此，該基因可能對(duì)稻瘟病菌的致病性產(chǎn)生一定的影響。

3 討論

稻瘟病是最具破壞性的植物病害之一，每年可造成10%～30%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)甚至造成顆粒無(wú)收，俗稱水稻的癌癥。目前，施用化學(xué)農(nóng)藥和培育抗性品種是防治稻瘟病的主要方法。隨著生態(tài)環(huán)境建設(shè)思想的貫徹執(zhí)行和人民綜合素質(zhì)的不斷提高，化學(xué)農(nóng)藥的使用逐漸減少，水稻抗性品種的選育和種植成為最經(jīng)濟(jì)有效的措施。深入了解水稻和稻瘟病菌的分子互作機(jī)制，有助于培育更加優(yōu)質(zhì)高效的水稻抗病品種。稻瘟病菌是最早完成全基因組測(cè)序的病原真菌。Dean等解析了稻瘟病菌實(shí)驗(yàn)室菌株70-15總長(zhǎng)度38.8Mb的序列，分析表明其含有11109個(gè)預(yù)測(cè)基因，其中包含1032個(gè)編碼分泌蛋白的基因。事實(shí)上，稻瘟病菌侵染水稻是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，大量分泌蛋白參與其中。例如，稻瘟病菌犕犆96基因編碼一個(gè)分泌蛋白。研究顯示，該基因突變后，不僅會(huì)顯著降低其致病性，而且會(huì)影響稻瘟病菌侵染菌絲的擴(kuò)展。Mosquera等研究表明，真菌侵染早期分泌的效應(yīng)蛋白具有較高的研究?jī)r(jià)值。已發(fā)表的稻瘟病菌犌犃犛1和犌犃犛2基因在附著胞形成過(guò)程中特異表達(dá)且編碼蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，預(yù)測(cè)有信號(hào)肽，表示它們可能從附著胞移動(dòng)到侵染菌絲，或運(yùn)送到寄主植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用;Catanzariti等還通過(guò)篩選亞麻銹菌吸器cDNA文庫(kù)，鑒定了21個(gè)特異表達(dá)的分泌蛋白。因此，本研究對(duì)在稻瘟病菌侵染初期8h誘導(dǎo)表達(dá)的MoIeep1基因進(jìn)行了初步的功能鑒定和分析，期望為進(jìn)一步開(kāi)展該基因在后續(xù)水稻稻瘟病菌分子互作機(jī)制研究中提供借鑒。

信號(hào)肽位于分泌蛋白的N 端，引導(dǎo)分泌蛋白離開(kāi)其合成所在的細(xì)胞到其他組織細(xì)胞。侵染寄主植物期間，病原真菌分泌蛋白干擾寄主免疫防衛(wèi)反應(yīng)。本研究采用酵母系統(tǒng)驗(yàn)證目的基因的信號(hào)肽。酵母是一種高效真核表達(dá)體系，本身含有較少的分泌蛋白，且酵母suc2基因編碼蔗糖轉(zhuǎn)換酶，可在以蔗糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而酵母突變體菌株YTK12因缺乏suc2基因，不能將蔗糖或棉籽糖轉(zhuǎn)化為可直接吸收利用的單糖，因此不能在蔗糖或棉籽糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。利用該特性，我們分別將含有全長(zhǎng)和不含信號(hào)肽的MoIeep1基因的pSUC2載體（含有suc2基因）轉(zhuǎn)化至YTK12酵母突

變體菌株感受態(tài)細(xì)胞并挑取單菌落涂板，若該基因含有信號(hào)肽，則只有含有該基因全長(zhǎng)的pSUC2載體（MoIEEP1_FL_pSUC2）可將蔗糖轉(zhuǎn)換酶分泌至胞外，并把培養(yǎng)基中的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖或果糖，從而在蔗糖培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而不含信號(hào)肽的pSUC2載體（MoIEEP1_NS_pSUC2）則不能在蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。本文研究結(jié)果與該假設(shè)一致，表MoIeep1基因的信號(hào)肽具有分泌活性，可能通過(guò)分泌到胞外執(zhí)行生物學(xué)功能。

蛋白質(zhì)的合成在核糖體上進(jìn)行，信號(hào)肽是蛋白質(zhì)的一個(gè)片段。“信號(hào)假說(shuō)”認(rèn)為信號(hào)肽引導(dǎo)核糖體定位并附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并使不斷伸長(zhǎng)的蛋白質(zhì)鏈通過(guò)水溶性通道，隨后信號(hào)肽被切割，合成的蛋白質(zhì)被釋放進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，隨蛋白分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。因此，信號(hào)肽不僅與蛋白質(zhì)的分泌特性相關(guān)，也與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)。近年來(lái)，原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于水稻功能基因組學(xué)研究。為進(jìn)一步探究MoIEEP1效應(yīng)蛋白在水稻細(xì)胞中的作用位點(diǎn)，結(jié)合在線平臺(tái)WoLFPROST 的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果，將目的基因構(gòu)建到含有綠色熒光蛋白基因的表達(dá)載體pYBA1132上并轉(zhuǎn)化至水稻原生質(zhì)體細(xì)胞，激光共聚焦觀察。該方法可以保持效應(yīng)蛋白的天然特性，靈敏度高，易于操作，試驗(yàn)周期相對(duì)較短。試驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白定位于水稻細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體或線粒體上，初步證明MoIEEP1可能通過(guò)影響寄主植物過(guò)氧化物酶體或線粒體上的蛋白受體或其他抗性相關(guān)蛋白，進(jìn)而調(diào)控植物抗病反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究首先通過(guò)轉(zhuǎn)錄分析MoIeep1基因在稻瘟病菌野生型菌株Guy11菌絲、孢子和不同侵染時(shí)期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在侵染初期8h表達(dá)量最高;信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明MoIEEP1N 端含有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，為分泌蛋白且定位于水稻細(xì)胞過(guò)氧化物酶體或線粒體上;通過(guò)構(gòu)建MoIeep1基因敲除突變體，證明其與稻瘟病菌野生型Guy11相比在生長(zhǎng)表型方面無(wú)明顯差異，但影響其致病性。因此推測(cè)該基因可能參與調(diào)控稻瘟病菌的致病性。