李翰文　劉歡歡　張敏等

中圖分類(lèi)號(hào)：S 432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh 2020114

灑金珊瑚Aucuba jaPonica又名東瀛珊瑚，為桃葉珊瑚屬Aucuba常綠叢生灌木，分布于長(zhǎng)江中下游地區(qū)，適應(yīng)性強(qiáng)，具備耐寒耐旱特性。在當(dāng)前園林綠化中被廣泛應(yīng)用，逐漸成為城市的主要綠化植物。關(guān)于灑金珊瑚的病害，國(guó)外相繼報(bào)道過(guò)炭疽病、根腐病、白粉病等。而在我國(guó)，灑金珊瑚移栽后炭疽病的發(fā)病率較高，危害較為嚴(yán)重，已成為灑金珊瑚種植過(guò)程中的主要病害。炭疽病由炭疽菌屬Colletotrichum真菌引起，許多炭疽菌存在復(fù)合種群，包含很多生物學(xué)上的種，目前國(guó)外可見(jiàn)殼皮炭疽菌C.crassipes、膠孢炭疽菌C.gloeos-porioides和黑線炭疽菌C.dematium引起灑金珊瑚炭疽病的記錄，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)I。i等12]通過(guò)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法，將灑金珊瑚炭疽病的病原菌鑒定為果生炭疽菌C.fructicola。炭疽病普遍存在一病多菌的現(xiàn)象，即一種植物可被幾種炭疽菌侵染，因此灑金珊瑚炭疽病的病原菌還有待進(jìn)一步確定。筆者從四川成都的6塊樣地，采集疑似灑金珊瑚炭疽病的病葉，對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化和致病性測(cè)定，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建明確灑金珊瑚炭疽病的病原菌種類(lèi)。

近年來(lái)成都市園林植物炭疽病普遍發(fā)生，由于灑金珊瑚常與其他園林植物搭配種植，周?chē)钆浞N植的植物如果發(fā)生炭疽病，是否會(huì)成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源目前尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者將在成都市園林植物上分離獲得的炭疽病病原菌，接種于灑金珊瑚上，若能產(chǎn)生病斑則有可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。明確灑金珊瑚炭疽病病原菌種類(lèi)及潛在侵染源，可為該病的診斷及科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物及病原菌：2017年6月至2018年7月從四川省成都市溫江區(qū)、武侯區(qū)、成華區(qū)、青羊區(qū)、金牛區(qū)及錦江區(qū)采集疑似為炭疽病的灑金珊瑚病葉。健康灑金珊瑚植株，購(gòu)自四川省成都市溫江區(qū)隨緣花廠。潛在侵染源測(cè)定的21株炭疽菌分離自四川省常種植于灑金珊瑚附近的16種園林植物，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1病原菌分離純化

采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，所得菌株用挑針轉(zhuǎn)移法進(jìn)行單孢純化，純化好的菌株于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2致病性測(cè)定

取健康灑金珊瑚葉片，無(wú)菌水清洗，用脫脂棉蘸取75%乙醇清洗表面，無(wú)菌水清洗3次后自然晾干。每張葉片用記號(hào)筆均勻分為四部分，每部分中心處用滅菌的梅花針刺傷葉片。處理組在葉片傷口處接種直徑5 mm的菌絲圓片，對(duì)照組在傷口處接種同樣大小的無(wú)菌PDA圓片。處理組及對(duì)照組各接種5片葉，每片葉接種4處，重復(fù)3次。處理組及對(duì)照組均置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。若對(duì)照組不發(fā)病，處理組發(fā)病且癥狀與田間癥狀相似，取發(fā)病部位進(jìn)行再分離，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。

1.2.3形態(tài)學(xué)觀察

觀察記錄單孢菌株菌落形態(tài)及菌絲生長(zhǎng)速率，挑取分生孢子制片，在顯微鏡下觀察分生孢子特征，并隨機(jī)選取100個(gè)分生孢子測(cè)量大小并顯微拍照，參考相關(guān)資料從形態(tài)上進(jìn)行初步鑒定。

參考Yang等的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子附著胞，參考Cai等的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生菌絲附著胞。在25℃黑暗條件下，分生孢子附著胞培養(yǎng)24 h，菌絲附著胞培養(yǎng)7d，觀察附著胞形態(tài)并顯微拍照，隨機(jī)選取50個(gè)測(cè)量大小。

1.2.4多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

收集待測(cè)菌株的菌絲體，采用生工生物工程股份有限公司（上海）Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟，提取菌絲DNA。采用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（rDNA internal transcribed spacer，ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（actin gene，ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）幾丁質(zhì)合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）、鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin gene，CAL）的引物對(duì)病原菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物由生工合成。25.0μL反應(yīng)體系參考楊友聯(lián)等方法。PCR產(chǎn)物由生工測(cè)序。各個(gè)基因所得序列與GenBank中的序列比對(duì)后，結(jié)合峰圖進(jìn)行手動(dòng)修改。在GenBank中下載與所測(cè)得序列相似性較高的序列及模式菌株序列。用ClustalX 1.81剪切后，按順序首尾相連，以甘薯黑痣病菌Monilochaetes infuscans （CBS869. 96）為外群，用PAUP v4. ob10軟件以最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建樹(shù)所用菌株及登錄號(hào)見(jiàn)表1。

1.2.5灑金珊瑚炭疽病潛在侵染源的測(cè)定

將在成都市園林植物上分離獲得的炭疽病菌（表4）活化后采用1.2.2的方法，接種于灑金珊瑚上，若能產(chǎn)生病斑則有可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。接種10 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，并根據(jù)病斑直徑對(duì)致病性強(qiáng)弱進(jìn)行記錄。如無(wú)病斑產(chǎn)生，則無(wú)致病性，記為“”;病斑直徑≤5 mm，致病性較弱，計(jì)為“+”;5mm<病斑直徑<10 mm，致病性中等，計(jì)為“++”;病斑直徑≥10 mm，致病性較強(qiáng)，計(jì)為“+++”。

發(fā)病率=（接種后發(fā)病葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1灑金珊瑚炭疽病病原菌的鑒定

2.1.1病原菌的分離培養(yǎng)

從6個(gè)采樣地分離出38株疑似為炭疽菌的菌株，單孢純化后根據(jù)菌落特征和孢子形態(tài)，得到22個(gè)代表菌株（表2）。

2.1.2致病性測(cè)定

將22個(gè)單孢菌株活化后回接到健康的灑金珊瑚葉片上，結(jié)果表明，接種10 d后，對(duì)照葉片均未發(fā)?。▓D1a），接種葉片全部發(fā)?。▓Dlb），癥狀均與自然發(fā)病的相似（圖1c）。從人工接種后發(fā)病葉片中分離病原菌，所得病原菌與原接種菌株特征一致，證明接種菌株均為灑金珊瑚炭疽病的致病菌。

2.1.3形態(tài)學(xué)觀察

單孢純化后的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)大致分為6類(lèi)（圖2）。第1類(lèi)（SJSH8）菌落正面灰黑色，氣生菌絲棉絮狀（圖2第1類(lèi)a），背面灰黑色，具有輪紋（圖2第1類(lèi)b）。第2類(lèi)（ SJSH10）菌落正面中間黑色，邊緣白色，氣生菌絲致密，有較多橘紅色的孢子堆（圖2第2類(lèi)a），背面中間黑色，邊緣白色，有明顯輪紋（圖2第2類(lèi)b）。第3類(lèi)（SJSH22）菌落正面白色，氣生菌絲稀疏（圖2第3類(lèi)a），背面白色，散生黑色顆粒（圖2第3類(lèi)b）。第4類(lèi)（ SJSH1、SJSH9、SJSH11、SJSH14、SJSH16、SJSH17）菌落正面白色，氣生菌絲較多（圖2第4類(lèi)a），背面淺橘色（圖2第4類(lèi)b）。第5類(lèi)（ SJSH2、SJSH3、SJSH5、SJSH6、SJSH7、SJSH12、SJSH15、SJSH19和SJSH21）菌落正面白色，氣生菌絲多（圖2第5類(lèi)a），背面淺灰色（圖2第5類(lèi)b）。第6類(lèi)（SJSH4、SJSH13、SJSH18、SJSH20）菌落正面白色，氣生菌絲稀疏（圖2第6類(lèi)a），背面白色，具有輪紋（圖2第6類(lèi)b）。各菌株菌絲生長(zhǎng)速率見(jiàn)表3。

在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)（圖2c），第1、4、5、6類(lèi)為圓柱形，一端鈍圓，另一端鈍圓或稍尖;第2類(lèi)為橢圓形，較短，兩端鈍圓;第3類(lèi)為橢圓形，較寬，一端鈍圓，另一端略尖。分生孢子附著胞（圖2d）第1、2類(lèi)為深褐色，橢圓形或不規(guī)則形，邊緣平滑或不規(guī)則;第3類(lèi)為深褐色，近球形，邊緣平滑;第4、5、6類(lèi)為淺褐色至深褐色，近球形，邊緣平滑。菌絲附著胞（圖2e）第1類(lèi)為深褐色，橢圓形，邊緣平滑;第2、5、6類(lèi)為淺褐色至深褐色，橢圓形或不規(guī)則形，邊緣平滑或不規(guī)則;第3類(lèi)為深褐色，不規(guī)則形;第4類(lèi)為深褐色，近球形，邊緣平滑。各菌株分生孢子、分生孢子附著胞及菌絲附著胞大小見(jiàn)表3。

2.1.4多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

以甘薯黑痣病菌為外群構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，樹(shù)長(zhǎng)TL=1230，一致性指數(shù)CI=0. 8805，保留指數(shù)RI=0.9243，校正一致性指數(shù)RC=0. 8138。從發(fā)育樹(shù)（圖3）可以看出，第1類(lèi)菌株（1株）與果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成明顯分支;第2類(lèi)菌株（1株）與隱秘炭疽菌C.aenigma聚在一起，形成明顯分支;第3類(lèi)菌株（1株）與喀斯特炭疽菌C.karstii聚在一起，形成明顯分支;第4、5、6類(lèi)菌株（19株）與暹羅炭疽菌C.siamense聚在一起，形成明顯分支。其他參與分析的炭疽菌與相應(yīng)的種聚在一起，形成明顯的分支，且每個(gè)分支的支持率均較高。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將第1類(lèi)菌株鑒定為果生炭疽菌C.fructicola Prihastuti，L.Cai&K.D. Hyde，第2類(lèi)菌株鑒定為隱秘炭疽菌C.aenigma B.Weir&P.R.Johnst，第3類(lèi)菌株鑒定為喀斯特炭疽菌C.karstii Y.L.Yang，Zuo Y.Liu，K.D.Hyde&L. Cai，第4、5、6類(lèi)菌株鑒定為暹羅炭疽菌C.Siamense Prihastuti，L.Cai&K.D.Hyde。

2.2灑金珊瑚炭疽病潛在侵染源測(cè)定

將其他園林植物上分離的炭疽病菌接種灑金珊瑚，除對(duì)照未發(fā)病外，其余菌株在人工接種條件下均能不同程度地引起灑金珊瑚發(fā)病，并表現(xiàn)出強(qiáng)弱不同的致病性，具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3討論

來(lái)自于溫江區(qū)、武侯區(qū)、成華區(qū)、青羊區(qū)、金牛區(qū)、錦江區(qū)的22株炭疽菌單孢菌株，隸屬于暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌、喀斯特炭疽菌和果生炭疽菌4個(gè)種，其中暹羅炭疽菌有19株，占總分離菌株的86.4%，且除成華區(qū)外其余5個(gè)區(qū)均分離到暹羅炭疽菌，暹羅炭疽菌應(yīng)為灑金珊瑚炭疽病的優(yōu)勢(shì)致病菌。進(jìn)一步驗(yàn)證了一種植物可被幾種炭疽菌所侵染。其中果生炭疽菌引起灑金珊瑚炭疽病的結(jié)果與Li等的結(jié)果相同。暹羅炭疽菌、隱秘炭疽菌及喀斯特炭疽菌引起灑金珊瑚炭疽病為首次報(bào)道。

根據(jù)菌落形態(tài)劃分的部分類(lèi)型與基于多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定的炭疽菌的種基本吻合，但暹羅炭疽菌存在3類(lèi)不同的菌落形態(tài)，因而在試驗(yàn)中不能根據(jù)菌落形態(tài)對(duì)菌株種類(lèi)進(jìn)行判定?？λ固靥烤揖稚咦拥拈L(zhǎng)和寬均與暹羅炭疽菌、果生炭疽菌和隱秘炭疽菌有明顯區(qū)別，其分生孢子附著胞在寬度上與其他種的分生孢子附著胞也具有明顯區(qū)別。因此分生孢子和分生孢子附著胞可作為鑒別炭疽菌的參考依據(jù)，但暹羅炭疽菌、果生炭疽菌和隱秘炭疽菌的分生孢子和分生孢子附著胞在長(zhǎng)和寬上具有一定的相似度，很難相互區(qū)分。加上很多復(fù)合種內(nèi)甚至不同復(fù)合種的炭疽菌常具有相似的形態(tài)特征，若想將炭疽菌準(zhǔn)確鑒定到種，還需要結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析進(jìn)一步鑒定。

本文中從其他園林植物上分離所得的21株炭疽菌，在人工接種條件下均可以引起灑金珊瑚發(fā)病，這些病原菌都可能成為灑金珊瑚炭疽病的潛在侵染源。在園林綠化中，為增加美觀度，普遍是多種植物搭配種植。在自然條件下病原菌很容易在多種不同植物間交互傳播，加重炭疽病的發(fā)生。因此在園林綠化中對(duì)炭疽病進(jìn)行防治時(shí)，應(yīng)對(duì)區(qū)域內(nèi)所有植物統(tǒng)籌制定防治措施，本試驗(yàn)研究結(jié)果可為園林綠化中炭疽病的防治奠定基礎(chǔ)。