吳佳鴻　黃金寶　劉梅等

摘要 由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍?。˙otryosphaeriadieback）是葡萄上的主要枝干病害之一，嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其中，致病力最強的為可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae。糖轉(zhuǎn)運蛋白在調(diào)節(jié)植物對病原菌的免疫過程中起著至關(guān)重要的作用，關(guān)于葡萄中糖轉(zhuǎn)運蛋白參與植物免疫機(jī)制的研究尚未見報道。本試驗從‘無核白葡萄葉片中克隆得到蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白VvSUC27基因，其開放閱讀框全長1515bp，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為54kD，理論等電點（pI）為9.58。生物信息學(xué)預(yù)測該蛋白含有12個跨膜結(jié)構(gòu)。實時熒光定量PCR（qRTPCR）分析表明：氨基環(huán)丙烷羧酸和脫落酸處理后VvSUC27的表達(dá)水平持續(xù)上調(diào);水楊酸和茉莉酸甲酯處理后，VvSUC27的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)表現(xiàn)但無規(guī)律的變化特征;激發(fā)子chitin和flg22處理后，VvSUC27基因信號響應(yīng)快速且明顯;感病品種‘夏黑接種可可毛色二孢后，VvSUC27被迅速誘導(dǎo)，3h時表達(dá)量達(dá)到最高，而后逐漸減弱。本研究將為今后闡明可可毛色二孢與葡萄互作的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 葡萄潰瘍病; 可可毛色二孢; 蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因; 基因克隆; 表達(dá)分析

中圖分類號： S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI： 10.16688/j.zwbh.202016

葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪集鮮食與加工于一身，是全球廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)果樹之一。葡萄枝干病害（grapevinetrunkdiseases，GTDs）是由多種病原真菌引起的危害葡萄枝干的病害統(tǒng)稱。由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍?。˙otryosphaeriadieback）是葡萄主產(chǎn)區(qū)最常見的枝干病害之一，病原菌主要通過傷口或自然孔口侵入，導(dǎo)致樹干變色壞死、果實枯萎腐爛，嚴(yán)重的整株植株枯死。近年來該病引起我國浙江、江蘇、廣西、湖南、河北等地葡萄減產(chǎn)30%～50%。在我國葡萄產(chǎn)區(qū)，本研究團(tuán)隊對引起葡萄潰瘍病的真菌進(jìn)行了形態(tài)觀察及分子鑒定，發(fā)現(xiàn)了包括葡萄座腔菌Botryo-sphaeria dothidea、Diplodia seriata、可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae、小新殼梭孢Neofusicoccum parvum、Lasiodiplodia、pseudo-theobromae和Neofusicoccum mangiferae在內(nèi)的6種葡萄座腔菌科真菌。其中，L.theobromae和B.dothidea是主要優(yōu)勢種群，L.theobromae是致病力最強的一種。葡萄潰瘍病已成為我國葡萄健康發(fā)展的重大障礙，但目前對該病害的致病機(jī)理還不明晰，生產(chǎn)上也還沒有建立起對應(yīng)的高效防控措施。糖類不僅是植物生長發(fā)育的必要因素，也是病原菌從宿主細(xì)胞吸收的主要碳源和能源物質(zhì)。糖轉(zhuǎn)運蛋白不僅介導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間糖的攝取與釋放，也介導(dǎo)植物病原體中糖的分配，其在植物質(zhì)膜上的分配是植物生長發(fā)育和應(yīng)對生物及非生物脅迫時最重要的過程之一。植物中糖轉(zhuǎn)運蛋白主要分成單糖轉(zhuǎn)運蛋白（MSTs）和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（sucrose transporters/sucrose carriers，SUTs/SUCs）兩類，這兩類糖轉(zhuǎn)運蛋白都屬于MFS蛋白超家族（Majorfacilitatorsuperfamily）。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUTs/SUCs）包含SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT55個亞族。已知的SUTs其氨基酸序列高度保守，為疏水性蛋白，包含由12個α螺旋組成的保守跨膜結(jié)構(gòu)域，中間面向胞質(zhì)的親水胞質(zhì)環(huán)將蛋白分為兩部分，每部分含6個跨膜結(jié)構(gòu)域，伸展的N 端序列也定位于胞質(zhì)。SUTs基因家族成員在植物的不同生長階段和不同部位表達(dá)，行使多種生物學(xué)功能，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。植物能夠調(diào)節(jié)糖轉(zhuǎn)運蛋白，將糖從感染部位重新分配出去，改變病原菌獲得營養(yǎng)物質(zhì)的途徑，消除病原體的能量來源，來限制它們的擴(kuò)散。玉米黑粉菌蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（UmSRT1）對蔗糖高度親和，寄主植物的ZmSUT1與其競爭蔗糖，病原菌通過直接吸收蔗糖來避免利用葡萄糖，進(jìn)而誘導(dǎo)防御機(jī)制。犝犿犛犚犜1 的缺失或ZmSUT1的上調(diào)表達(dá)都會造成病原菌毒力大大降低。馬鈴薯中過表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白SoSUT1導(dǎo)致叢枝菌根（arbuscularmycorrhizae，AM）真菌的定殖率增大。

迄今為止，預(yù)測葡萄基因組中有3個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因：VvSUC11，VvSUC12，VvSUC27，這3個基因均可在果實中表達(dá)，并且具有轉(zhuǎn)運蔗糖的功能。但對于葡萄中蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白參與免疫機(jī)制的調(diào)控目前還未見報道。前期的試驗中以可可毛色二孢菌株CSS01s、高感葡萄‘夏黑為研究對象，對可可毛色二孢侵染的‘夏黑葡萄進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，隨后通過差異表達(dá)基因的比對注釋，系統(tǒng)分析了侵染初期感病葡萄對可可毛色二孢防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因VvSUC27在感病樣品中存在差異表達(dá)。本研究從葡萄的cDNA中克隆獲得葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白VvSUC27基因，利用生物信息學(xué)和實時熒光定量PCR方法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明VvSUC27基因的生物功能奠定了基礎(chǔ)，同時也為解析其參與免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年9月在北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所進(jìn)行。葡萄‘夏黑枝條由北京市農(nóng)林科學(xué)院林果所提供。葡萄品種‘無核白組培苗由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院興城果樹研究所董雅鳳研究員提供。

可可毛色二孢菌株CSS01s由本實驗室分離并保存。LA Taq DNA 聚合酶、pMD18T 載體、SYBRPremixExTaq^TM購自寶生物工程有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript Ⅲ購自Invitrogen公司。E.coli Trana5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他常規(guī)化學(xué)藥品均為分析純。農(nóng)桿菌EHA105菌株和SuperGFP植物表達(dá)載體由本實驗室保存。flg22（鞭毛蛋白N端含保守的22個氨基酸的多肽：QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA，純度>95%）由艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司合成。幾丁質(zhì)chitin（C9752）購自Sigma公司。植物激素，水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、氨基環(huán)丙

烷羧酸（ACC）購自SigmaAldrich公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種處理

葡萄‘夏黑休眠枝條種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院溫室，將生根枝條以20cm×20cm 的間距移栽至25cm×25cm 的花盆中培養(yǎng)3 個月。接種按照Yan等方法稍作修改：將可可毛色二孢菌株CSS01s在PDA 培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)2d;半木質(zhì)化新生嫩枝用70%乙醇進(jìn)行表面消毒后，在莖中間用打孔器制造2mm 深的傷口，取直徑為4mm 的菌餅接種到傷口上并使用封口膜稍作固定，對照組接種無菌PDA 培養(yǎng)基塊;接種后的葡萄苗置于26～28℃、光周期L∥D=12h∥12h、相對濕度為85%～95%的植物接種室中;接種0、1、3、6、12h和24h時以傷口為中心截取4cm 范圍內(nèi)全部韌皮組織，采集的樣品在液氮中速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 激素及激發(fā)子處理

參照J(rèn)iao等的方法，將生長情況一致的‘無核白組培苗移栽至26～28℃人工氣候室，光周期L∥D=16h∥8h下培養(yǎng)3個月后，對材料進(jìn)行激素及激發(fā)子處理：將100μmol/L水楊酸、100μmol/L脫落酸、100μmol/L茉莉酸甲酯、100μmol/L氨基環(huán)丙烷羧酸、1μmol/Lflg22和10μg/mL幾丁質(zhì)分別噴施在葡萄葉片上，噴施量為（1.5±0.1）mL/株，同時以等體積滅菌ddH₂O處理為對照;暗培養(yǎng)并分別在處理0、1、3、6、12h和24h時采集葉片，每種處理設(shè)置3組重復(fù)。采集的葡萄葉片用液氮速凍后，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 RNA 提取及cDNA 合成

取上述激素處理、激發(fā)子處理和接種處理后的植物組織，采用多糖多酚/復(fù)雜植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量及完整性。NanoDrop2000（Thermo）對RNA 進(jìn)行定量后，利用SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 VvSUC27基因ORF的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)VvSUC27 序列（GenBank 登錄號：AF021810.2）設(shè)計特異性引物：上游引物SUC27F：5′ATGGAGTTAGCCAAGCCTTCTTCAG3′，下游引物SUC27R：5′AGACGACGGCTGAGTCCTCTCATCC3′。以葡萄‘無核白cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50μL）：10×PCRbuffer5μL;2.5mmol/LdNTPs2μL;10μmol/L上游和下游引物各1μL;LA Taq0.4μL;cDNA 模板2μL;補水至50μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，32個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Qiagen）回收目的片段，連接到pMD18T載體上，定名為SUC27T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，單克隆鑒定為陽性后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。采用DNAMAN6.0、ProtParam等軟件對其蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 基因表達(dá)分析

根據(jù)VvSUC27 基因序列設(shè)計實時熒光定量PCR特異引物，上游引物qS27F：5′ATCACCTACAGCATTCCAT3′，下游引物qS27R：5′CTACCGACACCATCATCT3′。以1.2.3制備的cDNA作為模板，每個樣品設(shè)3 次重復(fù)，用VvEF1γ（AF176496）作為內(nèi)參基因。參照TaKaRa說明書，采用SYBRGreenI染料法進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)在ABI7500 RealtimePCR 檢測系統(tǒng)上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaq^TM10μL;10μmol/L上游和下游引物各0.5μL;ROXReferenceDyeⅡ0.4μL;cDNA 模板0.5μL;補ddH2O至20μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s，60℃ 退火34s，40 個循環(huán);熔解曲線為95℃15s，60℃60s，95℃30s，60℃15s。VvSUC27基因的相對表達(dá)水平用2^-△△α犆狋法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄VvSUC27基因的克隆

以葡萄品種‘無核白cDNA為模板，SUC27F/R為引物擴(kuò)增得到1條1500bp左右的片段，測序并通過DNAMAN軟件將得到的序列與‘黑比諾參考序列（PN40024）進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，其開放閱讀框（ORF）序列長度一致，為1515bp;第164位核苷酸與參考序列存在差異，‘黑比諾中該位置為T，對應(yīng)氨基酸為亮氨酸（Leu）;‘無核白中為A，對應(yīng)氨基酸為組氨酸（His）（圖1）。

2.2 VvSUC27蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 VvSUC27蛋白的理化性質(zhì)分析

VvSUC27基因編碼505個氨基酸，包含22個酸性氨基酸（Asp+Glu），36個堿性氨基酸（Arg+Lys），編碼蛋白相對分子量為54kD，理論等電點（pI）為9.58。VvSUC27蛋白包含44.36%的α 螺旋（al pha helix）、14.65% 的延伸鏈區(qū)（extendedstrand）、4.16%的β轉(zhuǎn)角（beta turn）和36.83%的無規(guī)則卷曲（randomcoil）。應(yīng)用在線工具（http：∥wlab.ethz.ch/protter/start/）預(yù)測VvSUC27蛋白含有12個跨膜區(qū)（圖2）。

2.2.2 VvSUC27蛋白三 級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用SWISSMODEL對VvSUC27編碼氨基酸的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。葡萄VvSUC27蛋白的三級結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)復(fù)雜彎曲的交叉螺旋狀結(jié)構(gòu)，有12個明顯的α螺旋。

2.2.3 VvSUC27蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過同源性比對分析表明，葡萄VvSUC27蛋白與煙草NtSUC1a（CAA57727）蛋白和擬南芥AtSUC5（AEE35248）同源性最高分別為63.92% 和61.43%，說明其親緣關(guān)系最近（圖4）

2.3 VvSUC27基因的表達(dá)分析

激素處理后，VvSUC27基因表達(dá)量發(fā)生變化（圖5）：水楊酸（SA）處理后，VvSUC27基因表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，處理12h后表達(dá)量最高，約為對照的2 倍;茉莉酸甲酯（MeJA）處理后，VvSUC27基因表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，處理6h后表達(dá)量最高，約為對照的2倍;乙烯前體氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）處理后，犞狏犛犝犆27基因在1h時表達(dá)量最低，低于對照的1/2;處理12h后基因表達(dá)量上調(diào)。脫落酸（ABA）處理后，VvSUC犆27基因表達(dá)量有所下降，6h后恢復(fù)為與對照相當(dāng)水平，而后不斷上升，處理24h后達(dá)到峰值。

如圖6所示，在chitin誘導(dǎo)下，VvSUC27基因信號響應(yīng)十分快速且明顯，表達(dá)量在3h時達(dá)到峰值，約是對照的6倍，而后表達(dá)量逐漸降低;在flg22處理下，VvSUC27基因表達(dá)量升高，其中12h時表達(dá)量最高，約為對照的4倍，處理24h后表達(dá)量則基本恢復(fù)至與對照水平相當(dāng)。

接種可可毛色二孢后，VvSUC27表達(dá)量先升高，3h時達(dá)到峰值，約為對照的2.5倍;隨后表達(dá)量開始下降，接種12h時最低，約為對照的2倍（圖7）

3 討論

蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUTs/SUCs）是植物中特有的一類跨膜蛋白，在植物中廣泛存在，負(fù)責(zé)蔗糖經(jīng)韌皮部從源到庫的運輸以及庫組織的蔗糖供給，還參與蔗糖在庫組織的貯存。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白是一個十分龐大的家族，他們的共同特點是具有12個跨膜區(qū)的蛋白質(zhì)，在12個跨膜區(qū)域中，氨基酸是極為保守的，其中的疏水氨基酸幾乎完全不變，而N 端與C端為高變異區(qū)。最保守的跨膜區(qū)為第1、2和11跨膜區(qū)，但不同植物或相同植物的不同基因存在功能上的差異。Davies等于1999年從葡萄果實中克隆得到了3個推測可能是葡萄蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因。張雅麗等研究發(fā)現(xiàn)：VvSUC27在葡萄的根、幼葉以及果實等庫器官中大量表達(dá)，而在葉片中表達(dá)量很少，與Davies結(jié)果一致，初步認(rèn)為該基因很可能編碼特異性存在于庫組織中的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白;于菲等2011年對VvSUC27啟動子進(jìn)行了初步的功能預(yù)測分析。本研究克隆了葡萄VvSUC27 基因，利用生物信息學(xué)方法對該蛋白的理化性質(zhì)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果表明其cDNA 全長為1515bp，編碼505個氨基酸，VvSUC27蛋白具有12個跨膜結(jié)構(gòu)，與煙草蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白NtSUC1a的親緣關(guān)系最近，為63.92%，VvSUC27基因與許多已經(jīng)驗證功能的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因都有很高的同源性，具有糖轉(zhuǎn)運蛋白的活性。

目前糖轉(zhuǎn)運蛋白在生理以及非生物脅迫方面的作用已經(jīng)有了較深入的研究。植物中經(jīng)光合作用產(chǎn)生的糖分需要其運輸調(diào)控以保證自身各部分的營養(yǎng)供應(yīng)，非生物脅迫條件下糖轉(zhuǎn)運蛋白也會參與以適應(yīng)逆境。在玉米、小麥、馬鈴薯等植物中發(fā)現(xiàn)了參與植物與病原菌互作過程相關(guān)的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因。本研究通過對葡萄受可可毛色二孢侵染后不同時間VvSUC27基因表達(dá)量的檢測，證實病菌侵染誘導(dǎo)寄主植株VvSUC27 基因的表達(dá)量增加，推測VvSUC27基因參與了寄主對可可毛色二孢的調(diào)控。水楊酸、脫落酸、茉莉酸以及乙烯是植物免疫相關(guān)的激素，在不同病原菌侵染過程中，其在寄主體內(nèi)通過信號分子積累的改變來調(diào)節(jié)植物的免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，SA 和MeJA 處理6h即可誘導(dǎo)VvSUC27上調(diào)表達(dá);而ABA 和ACC 處理24h后，VvSUC27基因才出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。在病原菌與寄主的互作過程中，寄主植物細(xì)胞表面的模式受體（patternrecognitionreceptors，PRR）通過識別病原菌保守的病原相關(guān)分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns，PAMPs）激發(fā)PAMPs誘導(dǎo)的免疫（PAMPtriggeredimmunity，PTI），其中細(xì)菌的鞭毛蛋白（flagellin）、真菌的幾丁質(zhì)（chitin）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）等都是常見的病原菌保守組分。VvSUC27受flg22和chitin的誘導(dǎo)表達(dá)，推測其參與寄主植物的PTI反應(yīng)。

本文克隆了VvSUC27基因并分析了其在接種可可毛色二孢后以及不同激素和激發(fā)子處理下的表達(dá)情況。下一步將開展基因編輯、蛋白互作等工作，對葡萄中蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能及作用機(jī)理進(jìn)行深入研究。通過探索VvSUC27基因在可可毛色二孢與葡萄互作中的作用機(jī)制，為葡萄中其他蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)控機(jī)制研究提供一個新的切入點，為葡萄的遺傳改良提供理論參考。