陳英蘋(píng),周 琴,史 燁,張 玢,王 晶,劉建兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市婦幼保健院，常州 213003)

胎兒超聲是產(chǎn)前篩查與診斷的重要方法，對(duì)診斷胎兒染色體異常有重要的指導(dǎo)意義。胎兒超聲異常主要包括結(jié)構(gòu)異常和軟指標(biāo)異常兩大類型。對(duì)于超聲結(jié)構(gòu)異常，歐美及我國(guó)先后發(fā)表指南，推薦染色體微陣列技術(shù)(chromosomal mlcroarray analysis,CMA)作為首選的診斷方法[1-4]。而對(duì)于超聲軟指標(biāo)異常是否需行介入性產(chǎn)前診斷，可否采用孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing,NIPT)，存有較大爭(zhēng)議[5]。本研究回顧分析了本中心胎兒超聲異常產(chǎn)前篩查與診斷及隨訪結(jié)果，探討CMA及NIPT技術(shù)在胎兒超聲異常產(chǎn)前篩查與診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至2020年6月因胎兒超聲異常在常州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，知情同意自愿接受羊水產(chǎn)前診斷，進(jìn)行核型分析和(或)CMA檢測(cè)的孕婦，共356例，均為單胎妊娠，孕齡17～30周，年齡20～47歲。選取同期因單一超聲軟指標(biāo)異常(單枚左心室強(qiáng)光點(diǎn)、脈絡(luò)膜囊腫、單臍動(dòng)脈)，知情同意拒絕羊水產(chǎn)前診斷、自愿選擇NIPT的單胎非高齡孕婦415例，孕齡15～26周，年齡20～34歲。

1.2 研究方法

1.2.1 胎兒超聲檢查 胎兒超聲異常包括超聲結(jié)構(gòu)異常及軟指標(biāo)異常。使用超聲設(shè)備為G60S彩色多普勒超聲診斷儀(德國(guó)西門(mén)子公司)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《胎兒畸形產(chǎn)前超聲診斷學(xué)》[6]及相關(guān)文獻(xiàn)指南[7]。涉及胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常包括：神經(jīng)系統(tǒng)畸形、顏面頸部畸形、呼吸系統(tǒng)畸形、心血管系統(tǒng)畸形、消化系統(tǒng)畸形、泌尿系統(tǒng)畸形、骨骼系統(tǒng)畸形、多發(fā)畸形、羊水量異常、胎兒生長(zhǎng)受限、其他畸形(胎兒水腫及腫瘤)。涉及胎兒超聲軟指標(biāo)異常包括：NT/NF增厚、側(cè)腦室輕度增寬、脈絡(luò)膜囊腫、鼻骨發(fā)育不良、心室強(qiáng)光點(diǎn)、腸管回聲增強(qiáng)、單臍動(dòng)脈、三尖瓣反流。

1.2.2 NIPT檢測(cè) 孕婦知情同意后，采集外周血10mL置于EDTA抗凝管，4h以內(nèi)分離血漿，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(德國(guó)Qiagen公司)試劑盒提取血漿游離DNA，構(gòu)建文庫(kù)。采用Illumina NextSeq500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，獲得不低于400M的有效reads數(shù)，平均每個(gè)樣本不低于4M的reads。運(yùn)行序列比對(duì)軟件BWA map將測(cè)序所得序列比對(duì)至人類基因組參考序列圖譜。使用自有軟件BGPDv2.0.1針對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行每條染色體序列個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)算每條染色體reads所占比例(%hrN)，并計(jì)算各個(gè)染色體Z值。利用Z值評(píng)估樣本的實(shí)際患病情況(cutoff：|Z|=3)[8]。

1.2.3 CMA檢測(cè) 對(duì)超聲異常及NIPT結(jié)果異常孕婦均進(jìn)行產(chǎn)前遺傳咨詢，經(jīng)知情同意后在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，羊水標(biāo)本提取DNA，依次進(jìn)行酶切消化、連接、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、定量、片段化處理、標(biāo)記、雜交等過(guò)程，洗滌脫色，AffymetrixCytoScan750k芯片掃描獲得數(shù)據(jù)，并對(duì)所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。參照國(guó)際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV、OMIM、DECIPHER、ISCA等數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)判讀CNVs。結(jié)果解讀報(bào)告嚴(yán)格按美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)指南。

1.2.4 隨訪 采用病案查詢和電話等方式對(duì)妊娠結(jié)局、新生兒健康狀況進(jìn)行隨訪。

2 結(jié) 果

2.1 胎兒超聲異常產(chǎn)前診斷結(jié)果 356例因胎兒超聲異常接受產(chǎn)前診斷的孕婦共檢出44例致病性異常，異常率12.36%(44/356)，其中非整倍體異常30例(8.43%)，致病性微缺失或微重復(fù)14例(3.93%)。根據(jù)超聲異常分類，多發(fā)畸形異常率最高，達(dá)41.67%，其他依次為羊水量異常(1/4)、骨骼系統(tǒng)畸形(2/10)、神經(jīng)系統(tǒng)畸形(1/7)。其中多發(fā)畸形、軟指標(biāo)陽(yáng)性、羊水量異常以非整倍體異常為主，而神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)則以致病性拷貝數(shù)變異(PCNV)為主(表1)。

表1 不同類型胎兒超聲異常產(chǎn)前診斷結(jié)果一覽表

180例超聲軟指標(biāo)陽(yáng)性孕婦共檢出22例致病性異常，檢出率為12.22%(22/180)，包括17例(9.39%)非整倍體異常，5例(2.94%)致病性微缺失或微重復(fù)。NT/NF增厚異常率最高，達(dá)19.6%(12/61)，其他依次為腸管回聲增強(qiáng)(1/7)、鼻骨發(fā)育不良(5/42)、多種軟指標(biāo)異常(3/28)、側(cè)腦室輕度增寬(1/22)，單純性脈絡(luò)膜囊腫、心室強(qiáng)光點(diǎn)、單臍動(dòng)脈、三尖瓣返流未發(fā)現(xiàn)異常。見(jiàn)表2。

表2 不同類型超聲軟指標(biāo)產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.2 單一超聲軟指標(biāo)異常的NIPT結(jié)果 在文獻(xiàn)及上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們對(duì)3種單一胎兒超聲軟指標(biāo)陽(yáng)性孕婦在充分知情同意后謹(jǐn)慎選擇NIPT技術(shù)，共415例孕婦，包括198例脈絡(luò)膜囊腫、184例心室強(qiáng)光點(diǎn)和33例單臍動(dòng)脈。經(jīng)NIPT檢測(cè)，胎兒?jiǎn)渭兠}絡(luò)膜囊腫孕婦中，2例NIPT提示18-三體高風(fēng)險(xiǎn)，后經(jīng)羊水產(chǎn)前診斷確診(表3)。其余已隨訪的387例病例中，除1例單臍動(dòng)脈孕婦妊娠20周發(fā)生難免流產(chǎn)外，暫未發(fā)現(xiàn)結(jié)局不良病例，出生新生兒隨訪中暫未出現(xiàn)T21/T18/T13漏診病例。

表3 不同單一超聲軟指標(biāo)異常的NIPT結(jié)果

3 討 論

無(wú)創(chuàng)傷、可重復(fù)的超聲篩查是產(chǎn)前篩查與診斷的重要手段，在出生缺陷防治方面發(fā)揮巨大作用[9]，它通過(guò)檢查出染色體異?？赡芩碌幕位蛳嚓P(guān)細(xì)微結(jié)構(gòu)變化，再行介入性產(chǎn)前診斷，從而診斷出胎兒有無(wú)染色體異常。傳統(tǒng)的染色體核型分析需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，分辨率低，只能檢測(cè)出5～10Mb的染色體片段的重復(fù)和缺失，而CMA則能檢測(cè)出染色體微缺失、微重復(fù)等細(xì)微結(jié)構(gòu)異常，目前已廣泛應(yīng)用于超聲檢查異常的胎兒中[10]。本研究中，356例超聲異常共檢出44例致病性異常，包括非整倍體30例(8.43%)，致病性微缺失或微重復(fù)14例(3.93%)，CMA檢測(cè)增加了31.82%(14/44)染色體異常的發(fā)現(xiàn)。由此可見(jiàn)，CMA檢測(cè)是超聲異常的產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵方法，可有效提高致病性異常檢出率，起著重要作用。

胎兒軟指標(biāo)是指超聲發(fā)現(xiàn)胎兒微小的、一過(guò)性存在的非結(jié)構(gòu)性改變，對(duì)胎兒染色體異常有提示作用[11]。但迄今為止，關(guān)于單純性胎兒軟指標(biāo)產(chǎn)前診斷的研究報(bào)道甚少。本研究180例超聲軟指標(biāo)陽(yáng)性樣本中，共檢出22例致病性異常，檢出率為12.22%(22/180)。異常率最高為NT/NF增厚(19.6%)，其他依次為腸管回聲增強(qiáng)(14.28%)、鼻骨發(fā)育不良(11.90%)、多種軟指標(biāo)異常(10.71%)、側(cè)腦室輕度增寬(4.55%)。故對(duì)于異常率較高的軟指標(biāo)異常(如NT/NF增厚、腸管回聲增強(qiáng)、鼻骨發(fā)育不良)或合并多個(gè)軟指標(biāo)異常，建議直接行介入性產(chǎn)前診斷。然而本研究臨床數(shù)據(jù)尚有限，有待進(jìn)行更深入、更大樣本量的研究。

NIPT作為一項(xiàng)新型的產(chǎn)前非侵入性高精度篩查方法，對(duì)于檢測(cè)胎兒21-三體和18-三體檢測(cè)具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，其結(jié)果與染色體核型分析具有較高的一致性[12]。本研究根據(jù)以往臨床研究結(jié)果，在充分知情同意下對(duì)單一超聲軟指標(biāo)異常(脈絡(luò)膜囊腫、心室強(qiáng)光點(diǎn)、單臍動(dòng)脈)拒絕行羊水產(chǎn)前診斷而要求行NIPT，結(jié)果顯示，198例脈絡(luò)膜囊腫樣本中發(fā)現(xiàn)2例18-三體綜合征，異常率1.01%，184例心室強(qiáng)光點(diǎn)及33例單臍動(dòng)脈樣本中未發(fā)現(xiàn)結(jié)果異常。而表2行產(chǎn)前診斷的脈絡(luò)膜囊腫、心室強(qiáng)光點(diǎn)、單臍動(dòng)脈樣本中，結(jié)果亦未發(fā)現(xiàn)異常。正常胎兒脈絡(luò)膜囊腫發(fā)生率為1%～2%，并于孕26周消失，故早期發(fā)現(xiàn)單純的脈絡(luò)膜囊腫，可動(dòng)態(tài)觀察，若存在其他高危因素可再考慮行產(chǎn)前診斷。胎兒軟指標(biāo)陽(yáng)性染色體異常多見(jiàn)于非整倍異常，NIPT對(duì)于檢測(cè)常見(jiàn)的21-三體、18-三體均具有較高的準(zhǔn)確性，且隨著目前測(cè)序深度的不斷增加、信息分析方法的逐漸優(yōu)化，NIPT對(duì)染色體部分微缺失微重復(fù)亦有一定的檢出率。故對(duì)于單一的脈絡(luò)膜囊腫、心室強(qiáng)光點(diǎn)、單臍動(dòng)脈可先行NIPT，從而減少侵入性產(chǎn)前診斷所帶來(lái)的流產(chǎn)、感染等風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，CMA技術(shù)可顯著提高胎兒超聲異常產(chǎn)前診斷的異常染色體檢出率，可作為首選方法。胎兒超聲軟指標(biāo)異常因類型不同，染色體異常檢出率存在明顯差異，故在實(shí)際臨床工作中產(chǎn)前診斷醫(yī)師應(yīng)綜合評(píng)估分析，選擇適宜的產(chǎn)前診斷技術(shù)。對(duì)于致病性CNV較低的單一軟指標(biāo)陽(yáng)性，亦可考慮先行NIPT，同時(shí)加強(qiáng)后期圍產(chǎn)期的監(jiān)護(hù)。