鹽脅迫對黃蜀葵不同部位總黃酮含量及抗氧化活性的影響

寧亞茹　韓民利　張曉東　李俊萍　王秀萍

摘要：為探明鹽脅迫對黃蜀葵不同部位總黃酮的含量及抗氧化活性影響。采用自吸水梯度鑒定法，研究了梯度鹽脅迫下黃蜀葵花、根、莖、葉的總黃酮含量及其抗氧化活性的變化規(guī)律，為黃蜀葵功能產(chǎn)品的開發(fā)，鹽堿地區(qū)黃蜀葵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，黃蜀葵不同部位總黃酮含量為花>葉>莖>根。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時，黃蜀葵花中總黃酮含量最高，達5.018%，其中，金絲桃苷含量較高，達1.416%;而金絲桃苷在黃蜀葵莖、葉和根中含量利用HPLC法已經(jīng)無法檢出。當(dāng)鹽脅迫濃度在2 g/L時，黃蜀葵花的抗氧化活性最高，T-AOC 能力為3.4 U/mL、·OH 清除率為98.45%、DPPH自由基清除率84.65%。說明2～3 g/L低鹽脅迫有利于黃蜀葵總黃酮的積累，可提高其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：黃蜀葵;鹽脅迫;HPLC;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號：S567.21+9.01;R284 文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0196-05

黃蜀葵[Abelmoschus manihot （L）]，又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉，為錦葵科秋葵屬1年生草本植物，且其為一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，干燥花冠入藥，具有清利濕熱、消炎解毒等功效^[1-3]。黃蜀葵含有黃酮類化合物、不飽和脂肪酸及鋅、硒、鐵人體必需微量元素等，黃酮類化合物是最主要的功能成分，且含量超出目前黃酮生產(chǎn)常用原料銀杏、大豆等數(shù)十倍^[4-5]，具有抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力、降低心血管疾病發(fā)生、抗炎、抗菌、降血糖等生理活性，黃蜀葵功能產(chǎn)品市場開發(fā)潛力很大^[6-7]。

濱海鹽漬土是鹽漬化土壤的一種類型，土壤NaCl含量高，通透性差，嚴(yán)重影響作物的生長^[8]。篩選耐鹽經(jīng)濟植物，既有經(jīng)濟價值并改善當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的植被），改良濱海鹽土，是鹽堿地改良利用最經(jīng)濟有效的方法。黃蜀葵對土壤要求不嚴(yán)，抗旱耐澇，適應(yīng)性較強，具有一定的耐鹽能力^[9]，可在我國濱海地區(qū)大面積種植，不僅能夠高效利用鹽土資源，改良修復(fù)鹽堿地，還可發(fā)展鹽堿地功能植物開發(fā)利用產(chǎn)業(yè)，為濱海鹽堿區(qū)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效探索新途徑，為濱?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展提供新模式。

不同植物耐鹽機理不同，鹽脅迫對同一植物的不同部位功能成分影響也不同。對于耐鹽性較強的植物而言，低濃度鹽脅迫在一定程度上會促進植物的生長;高濃度鹽脅迫下，植物雖株高降低、莖粗減小、干質(zhì)量降低，但其依舊存活^[10]。陳云香等比較了黃蜀葵花、莖、葉多糖與黃酮含量^[11];李佳慧研究了黃蜀葵不同藥用部位總黃酮、多糖、金絲桃苷的含量[12];饒琳莉等研究了鹽脅迫對黃蜀葵花中金絲桃苷累積影響^[13];張曉倩等研究了鹽脅迫對黃蜀葵生長及金絲桃苷含量的影響^[14]。國內(nèi)外關(guān)于鹽脅迫對黃蜀葵不同部位功能成分及活性影響均無相關(guān)文獻報道，為探明鹽脅迫對黃蜀葵根、莖、葉、花不同部位的功能性成分總黃酮含量及抗氧化活性的影響，本研究采用自吸水設(shè)施梯度耐鹽鑒定法，人為設(shè)置7種鹽脅迫濃度進行試驗，為黃蜀葵功能產(chǎn)品研發(fā)及其在濱海鹽堿區(qū)的合理開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料黃蜀葵品種由河北清竹農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，在河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所綜合試驗基地塑料遮雨棚內(nèi)進行試驗。在開花期160 d時，均勻采集不同鹽脅迫處理的黃蜀葵鮮花、葉、莖、根樣品同步進行試驗。

1.2試劑和儀器設(shè)備

氯化鈉，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇（分析純），天津市恒興化學(xué)試劑制造;磷酸，甲醇（色譜純），F(xiàn)isher Chemical;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer有限公司;DPPH，麥克林試劑公司;純凈水，屈臣氏純凈水。

FA2004B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀，上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司;KQ2200V型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Heidolph，天津西納國際貿(mào)易有限公司;高效液相色譜儀，美國Agilent公司;TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗設(shè)計

黃蜀葵采用盆栽法，過篩后將土壤改為草炭 ∶蛭石 ∶珍珠巖=2 ∶1 ∶1^[15]。采用NaCl配成的1、2、3、5、7、9 g/L等6個濃度鹽水，以清水為對照（CK），每盆3株黃蜀葵，每個濃度設(shè)6盆進行平行試驗。

1.4樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g干粉，加入80%乙醇25 mL，超聲處理1 h，超聲波功率100 W，水浴溫度50 ℃。冷卻至室溫后，4 000 r/min離心25 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用少量甲醇（色譜純）溶解，備用^[16]。

1.5總黃酮含量的測定

HPLC條件：色譜柱為鉆石1代C18 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相A（體積分?jǐn)?shù)0.02%磷酸水溶液） ∶B（甲醇）= 50 ∶50;檢測波長350 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;進樣量10 μL^[16]。流動相均經(jīng)真空泵過濾除雜和超聲清洗機脫氣。

以蕓香苷和金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積定量，對不同鹽脅迫濃度脅迫的黃蜀葵不同部位提取液進行HPLC分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過回歸方程對黃蜀葵花、莖、葉和根中的總黃酮進行定量分析。

1.6黃蜀葵抗氧化活性

1.6.1總抗氧化能力（T-AOC）測定體外總抗氧化能力采用Fe³⁺還原試劑盒測定，酸性環(huán)境下，黃蜀葵提取液中的抗氧化物質(zhì)能使Fe³⁺還原成Fe^2+[17]。利用分光光度計在593 nm波長處測定其吸光度，每個樣品平行測定3次。按照試劑盒計算黃蜀葵提取液總抗氧化能力（T-AOC）（U/mg）。

1.6.2黃蜀葵清除DPPH自由基能力的測定分別取不同鹽脅迫處理的提取液1.0 mL，置于10 mL離心管中，加入3.0 mL的0.004% DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)30 min，無水乙醇為空白，于517 nm波長處測定吸光度。按公式計算DPPH自由基清除率^[18]。試驗重復(fù)3次。

式中：D₀為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_s為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_c為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度。

1.6.3黃蜀葵清除羥基能力的測定清除· OH能力的測定采用Fenton反應(yīng)試劑盒法，F(xiàn)e²⁺與H₂O₂通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生· OH，將鄰二氮菲-Fe²⁺水溶液中Fe²⁺氧化成Fe³⁺，從而導(dǎo)致536 nm下吸光度下降，樣品536 nm吸光度下降速率的抑制程度反映其清除自由基的能力。取不同鹽脅迫處理的黃蜀葵提取物進行試驗，以蒸餾水調(diào)0，在536 nm波長處測定吸光度。每個樣品平行測3次。按照試劑盒計算抑制·OH清除率（%）。

1.7數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用“x±s”表示，采用t檢驗方法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及黃蜀葵活性成分液相圖譜

選取6個不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行液相分析，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=15 467_x+1.9，決定系數(shù)（r^₂）0.999 6，有效測試濃度在0.0～0.1 mg/mL范圍內(nèi);金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=27 146x-19.905，決定系數(shù)0.999 6，有效測試濃度在0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)。通過高效液相色譜法測得標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷保留時間為8.885 min;標(biāo)準(zhǔn)品金絲桃苷保留時間為9.732 min。圖1為黃蜀葵提取液HPLC色譜圖，以黃蜀葵花為例。

2.2鹽脅迫對黃蜀葵花中總黃酮含量的影響

黃蜀葵花中總黃酮含量是黃蜀葵全株總黃酮含量最高的部位，其中金絲桃苷是黃蜀葵中主要活性成分之一。1 g/L鹽脅迫下，花中總黃酮的含量與CK相比無顯著性差異;而當(dāng)鹽脅迫濃度≥2 g/L時，與CK相比表現(xiàn)出顯著性差異。低濃度的鹽脅迫可以使黃蜀葵花中總黃酮含量增加，在鹽脅迫濃度為2 g/L時，黃蜀葵花中總黃酮含量最高，為5.018%，但在鹽脅迫濃度為3 g/L（3.724%）時，與CK（4209%）相比呈下降趨勢，出現(xiàn)此結(jié)果的原因有待進一步研究。

由圖2和圖3可知，隨著鹽脅迫濃度增加，金絲桃苷含量的變化規(guī)律與黃酮含量變化基本一致。在鹽脅迫濃度為2 g/L時，黃蜀葵花中金絲桃苷含量達到最大值1.416%，與CK相比有顯著的提高，3、7 g/L鹽脅迫處理與對CK相比差異不顯著。說明一定濃度的鹽脅迫有利于黃蜀葵花中金絲桃苷的積累。

2.3鹽脅迫對黃蜀葵葉中總黃酮含量的影響

由圖4可知，隨著鹽脅迫濃度增加，黃蜀葵葉中總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，且不同濃度的鹽脅迫對黃蜀葵葉中的總黃酮含量影響顯著。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時，黃蜀葵葉中總黃酮含量達到最高值，為0.778%，與CK（0.6%）相比增加297%;當(dāng)鹽脅迫濃度>3 g/L時，黃蜀葵葉中總黃酮含量開始呈下降趨勢，在鹽脅迫濃度為9g/L

（0.416%）時，黃蜀葵葉中總黃酮含量比CK顯著低30.7%。綜上所述，輕度鹽脅迫可以提高黃蜀葵葉中總黃酮含量。在黃蜀葵葉、莖、根中總黃酮含量較低，金絲桃苷的含量利用HPLC法已經(jīng)無法檢出。

2.4鹽脅迫對黃蜀葵莖中總黃酮含量的影響

由圖5可知，黃蜀葵莖中總黃酮含量變化趨勢不明顯。1、3 g/L鹽脅迫下莖中的總黃酮含量與CK相比無顯著性差異，鹽脅迫濃度為7 g/L（0171%）對黃蜀葵莖中總黃酮含量提高幅度相對較大，與CK（0.160%）相比提高了6.9%;與CK相比，最大下降量是鹽脅迫濃度為9 g/L（0.139%）時，下降了13.1%。

2.5鹽脅迫對黃蜀葵根中總黃酮含量的影響

由圖6可知，隨著鹽脅迫濃度增加，黃蜀葵根中總黃酮含量呈先下降后上升的趨勢，與鹽脅迫對黃蜀葵其他部位的影響不同，呈現(xiàn)出低鹽脅迫降低總黃酮含量、高鹽脅迫提高總黃酮含量的現(xiàn)象。在剛開始脅迫時，黃蜀葵根中總黃酮含量有下降的趨勢，在鹽脅迫濃度為3 g/L（0.028%）時，黃蜀葵根中總黃酮含量與CK（0.040%）相比下降了30%;當(dāng)鹽脅迫濃度>3 g/L時，黃蜀葵根中總黃酮含量呈上升趨勢，其中鹽脅迫濃度為7 g/L（0.048%）時，黃蜀葵根中總黃酮含量比CK增加20%。

2.6鹽脅迫對黃蜀葵花抗氧化活性的影響

黃蜀葵花中的黃酮含量明顯高于其他部位，因此，利用黃蜀葵花提取液進行抗氧化試驗，探究鹽脅迫對黃蜀葵抗氧化活性的影響。由表1可知，在T-AOC能力、·OH清除率、DPPH自由基清除率3個抗氧化活性指標(biāo)中，黃蜀葵花醇提液的·OH清除能力最高，而T-AOC能力相對較弱。當(dāng)鹽脅迫濃度在2 g/L時，黃蜀葵花的抗氧化活性最高，T-AOC能力為3.4 U/mL、·OH清除率為98.45%、DPPH自由基清除率8465%;當(dāng)鹽脅迫濃度在3 g/L時，抗氧化活性均最低，此結(jié)果與“2.2”節(jié)中總黃酮含量相一致，其他鹽脅迫濃度組抗氧化活性無明顯規(guī)律，且與總黃酮含量無明顯對應(yīng)關(guān)系。鹽濃度在0～2 g/L 時，隨鹽脅迫濃度升高·OH清除率升高;但鹽脅迫濃度超過3 g/L時，·OH清除率下降。說明高于2 g/L的鹽脅迫濃度會使·OH清除降低。

3結(jié)論與討論

3.1不同部位總黃酮含量

目前，關(guān)于黃蜀葵不同部位總黃酮含量的相關(guān)文獻極少，本試驗比較了黃蜀葵不同部位總黃酮含量。結(jié)果顯示，各部位醇提液中總黃酮含量為花>葉>莖>根，其原因可能是不同生長時期不同部位對總黃酮積累不同。黃蜀葵花中總黃酮含量最高，有極高的利用價值，而黃蜀葵根、莖、葉中總黃酮含量較少，但其可能含有較高的其他功能性物質(zhì)，如陳云香等研究發(fā)現(xiàn)黃蜀葵葉和莖中多糖含量很高^[11]。黃蜀葵全身是寶，不同部位所含功能物質(zhì)不同，因此黃蜀葵功能產(chǎn)品的開發(fā)更有針對性。

3.2不同部位金絲桃苷含量

在鹽脅迫濃度為2 g/L下，黃蜀葵花中金絲桃苷達到最大值，與CK相比有顯著差異;而金絲桃苷在莖和葉中未檢出，表明金絲桃苷是黃蜀葵花中總黃酮的指標(biāo)性成分。張曉倩等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl 濃度為0.3%時，金絲桃苷含量達到最大，當(dāng)NaCl濃度為0.7%時，金絲桃苷含量急劇下降，說明鹽脅迫并不能無限制誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物增加，當(dāng)鹽濃度超過一定臨界值，植株遭受鹽害，將影響代謝產(chǎn)物的合成^[15]。綜上，低濃度鹽脅迫有利于金絲桃苷的積累。

綜上所述，黃蜀葵不同部位總黃酮含量為花>葉>莖>根。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時，黃蜀葵黃酮含量與金絲桃苷含量均達到最大值，而黃蜀葵根莖葉中金絲桃苷無檢出。黃蜀葵的抗氧化活性規(guī)律與總黃酮含量規(guī)律大致相同，均在鹽脅迫濃度為2 g/L時達到最高，說明在黃蜀葵花中總黃酮起到主要的抗氧化活性。

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基金項目：河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃（編號：16226304D）;河北省唐山市科技創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃（編號：18130206B）。

作者簡介：寧亞茹（1992—），女，河北唐山人，碩士，助理研究員，主要從事耐鹽植物研究。E-mail：2501116178@qq.com。

通信作者：王秀萍，研究員，主要從事耐鹽植物高效利用研究。E-mail：bhswxp@163.com。