寧亞茹 韓民利 張曉東 李俊萍 王秀萍
摘要:為探明鹽脅迫對黃蜀葵不同部位總黃酮的含量及抗氧化活性影響。采用自吸水梯度鑒定法,研究了梯度鹽脅迫下黃蜀葵花、根、莖、葉的總黃酮含量及其抗氧化活性的變化規(guī)律,為黃蜀葵功能產(chǎn)品的開發(fā),鹽堿地區(qū)黃蜀葵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。結(jié)果表明,黃蜀葵不同部位總黃酮含量為花>葉>莖>根。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時,黃蜀葵花中總黃酮含量最高,達5.018%,其中,金絲桃苷含量較高,達1.416%;而金絲桃苷在黃蜀葵莖、葉和根中含量利用HPLC法已經(jīng)無法檢出。當(dāng)鹽脅迫濃度在2 g/L時,黃蜀葵花的抗氧化活性最高,T-AOC 能力為3.4 U/mL、·OH 清除率為98.45%、DPPH自由基清除率84.65%。說明2~3 g/L低鹽脅迫有利于黃蜀葵總黃酮的積累,可提高其抗氧化活性。
關(guān)鍵詞:黃蜀葵;鹽脅迫;HPLC;總黃酮;抗氧化活性
中圖分類號:S567.21+9.01;R284 文獻標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2021)19-0196-05
黃蜀葵[Abelmoschus manihot (L)],又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉,為錦葵科秋葵屬1年生草本植物,且其為一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物,干燥花冠入藥,具有清利濕熱、消炎解毒等功效[1-3]。黃蜀葵含有黃酮類化合物、不飽和脂肪酸及鋅、硒、鐵人體必需微量元素等,黃酮類化合物是最主要的功能成分,且含量超出目前黃酮生產(chǎn)常用原料銀杏、大豆等數(shù)十倍[4-5],具有抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力、降低心血管疾病發(fā)生、抗炎、抗菌、降血糖等生理活性,黃蜀葵功能產(chǎn)品市場開發(fā)潛力很大[6-7]。
濱海鹽漬土是鹽漬化土壤的一種類型,土壤NaCl含量高,通透性差,嚴(yán)重影響作物的生長[8]。篩選耐鹽經(jīng)濟植物,既有經(jīng)濟價值并改善當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的植被),改良濱海鹽土,是鹽堿地改良利用最經(jīng)濟有效的方法。黃蜀葵對土壤要求不嚴(yán),抗旱耐澇,適應(yīng)性較強,具有一定的耐鹽能力[9],可在我國濱海地區(qū)大面積種植,不僅能夠高效利用鹽土資源,改良修復(fù)鹽堿地,還可發(fā)展鹽堿地功能植物開發(fā)利用產(chǎn)業(yè),為濱海鹽堿區(qū)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效探索新途徑,為濱?,F(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展提供新模式。
不同植物耐鹽機理不同,鹽脅迫對同一植物的不同部位功能成分影響也不同。對于耐鹽性較強的植物而言,低濃度鹽脅迫在一定程度上會促進植物的生長;高濃度鹽脅迫下,植物雖株高降低、莖粗減小、干質(zhì)量降低,但其依舊存活[10]。陳云香等比較了黃蜀葵花、莖、葉多糖與黃酮含量[11];李佳慧研究了黃蜀葵不同藥用部位總黃酮、多糖、金絲桃苷的含量[12];饒琳莉等研究了鹽脅迫對黃蜀葵花中金絲桃苷累積影響[13];張曉倩等研究了鹽脅迫對黃蜀葵生長及金絲桃苷含量的影響[14]。國內(nèi)外關(guān)于鹽脅迫對黃蜀葵不同部位功能成分及活性影響均無相關(guān)文獻報道,為探明鹽脅迫對黃蜀葵根、莖、葉、花不同部位的功能性成分總黃酮含量及抗氧化活性的影響,本研究采用自吸水設(shè)施梯度耐鹽鑒定法,人為設(shè)置7種鹽脅迫濃度進行試驗,為黃蜀葵功能產(chǎn)品研發(fā)及其在濱海鹽堿區(qū)的合理開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。
1材料與方法
1.1試驗材料
供試材料黃蜀葵品種由河北清竹農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,在河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所綜合試驗基地塑料遮雨棚內(nèi)進行試驗。在開花期160 d時,均勻采集不同鹽脅迫處理的黃蜀葵鮮花、葉、莖、根樣品同步進行試驗。
1.2試劑和儀器設(shè)備
氯化鈉,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇(分析純),天津市恒興化學(xué)試劑制造;磷酸,甲醇(色譜純),F(xiàn)isher Chemical;蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品,德國Dr.Ehrenstorfer有限公司;DPPH,麥克林試劑公司;純凈水,屈臣氏純凈水。
FA2004B電子天平,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀,上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司;KQ2200V型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Heidolph,天津西納國際貿(mào)易有限公司;高效液相色譜儀,美國Agilent公司;TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
1.3試驗設(shè)計
黃蜀葵采用盆栽法,過篩后將土壤改為草炭 ∶蛭石 ∶珍珠巖=2 ∶1 ∶1[15]。采用NaCl配成的1、2、3、5、7、9 g/L等6個濃度鹽水,以清水為對照(CK),每盆3株黃蜀葵,每個濃度設(shè)6盆進行平行試驗。
1.4樣品處理
準(zhǔn)確稱取1 g干粉,加入80%乙醇25 mL,超聲處理1 h,超聲波功率100 W,水浴溫度50 ℃。冷卻至室溫后,4 000 r/min離心25 min,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用少量甲醇(色譜純)溶解,備用[16]。
1.5總黃酮含量的測定
HPLC條件:色譜柱為鉆石1代C18 (4.6 mm ×250 mm,5 μm);流動相A(體積分?jǐn)?shù)0.02%磷酸水溶液) ∶B(甲醇)= 50 ∶50;檢測波長350 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;進樣量10 μL[16]。流動相均經(jīng)真空泵過濾除雜和超聲清洗機脫氣。
以蕓香苷和金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積定量,對不同鹽脅迫濃度脅迫的黃蜀葵不同部位提取液進行HPLC分析,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,通過回歸方程對黃蜀葵花、莖、葉和根中的總黃酮進行定量分析。
1.6黃蜀葵抗氧化活性
1.6.1總抗氧化能力(T-AOC)測定體外總抗氧化能力采用Fe3+還原試劑盒測定,酸性環(huán)境下,黃蜀葵提取液中的抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+[17]。利用分光光度計在593 nm波長處測定其吸光度,每個樣品平行測定3次。按照試劑盒計算黃蜀葵提取液總抗氧化能力(T-AOC)(U/mg)。
1.6.2黃蜀葵清除DPPH自由基能力的測定分別取不同鹽脅迫處理的提取液1.0 mL,置于10 mL離心管中,加入3.0 mL的0.004% DPPH溶液,室溫避光反應(yīng)30 min,無水乙醇為空白,于517 nm波長處測定吸光度。按公式計算DPPH自由基清除率[18]。試驗重復(fù)3次。
式中:D0為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;Ds為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;Dc為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度。
1.6.3黃蜀葵清除羥基能力的測定清除· OH能力的測定采用Fenton反應(yīng)試劑盒法,F(xiàn)e2+與H2O2通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生· OH,將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化成Fe3+,從而導(dǎo)致536 nm下吸光度下降,樣品536 nm吸光度下降速率的抑制程度反映其清除自由基的能力。取不同鹽脅迫處理的黃蜀葵提取物進行試驗,以蒸餾水調(diào)0,在536 nm波長處測定吸光度。每個樣品平行測3次。按照試劑盒計算抑制·OH清除率(%)。
1.7數(shù)據(jù)分析
試驗數(shù)據(jù)用“x±s”表示,采用t檢驗方法,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件。
2結(jié)果與分析
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及黃蜀葵活性成分液相圖譜
選取6個不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行液相分析,以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=15 467x+1.9,決定系數(shù)(r2)0.999 6,有效測試濃度在0.0~0.1 mg/mL范圍內(nèi);金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=27 146x-19.905,決定系數(shù)0.999 6,有效測試濃度在0~0.1 mg/mL范圍內(nèi)。通過高效液相色譜法測得標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷保留時間為8.885 min;標(biāo)準(zhǔn)品金絲桃苷保留時間為9.732 min。圖1為黃蜀葵提取液HPLC色譜圖,以黃蜀葵花為例。
2.2鹽脅迫對黃蜀葵花中總黃酮含量的影響
黃蜀葵花中總黃酮含量是黃蜀葵全株總黃酮含量最高的部位,其中金絲桃苷是黃蜀葵中主要活性成分之一。1 g/L鹽脅迫下,花中總黃酮的含量與CK相比無顯著性差異;而當(dāng)鹽脅迫濃度≥2 g/L時,與CK相比表現(xiàn)出顯著性差異。低濃度的鹽脅迫可以使黃蜀葵花中總黃酮含量增加,在鹽脅迫濃度為2 g/L時,黃蜀葵花中總黃酮含量最高,為5.018%,但在鹽脅迫濃度為3 g/L(3.724%)時,與CK(4209%)相比呈下降趨勢,出現(xiàn)此結(jié)果的原因有待進一步研究。
由圖2和圖3可知,隨著鹽脅迫濃度增加,金絲桃苷含量的變化規(guī)律與黃酮含量變化基本一致。在鹽脅迫濃度為2 g/L時,黃蜀葵花中金絲桃苷含量達到最大值1.416%,與CK相比有顯著的提高,3、7 g/L鹽脅迫處理與對CK相比差異不顯著。說明一定濃度的鹽脅迫有利于黃蜀葵花中金絲桃苷的積累。
2.3鹽脅迫對黃蜀葵葉中總黃酮含量的影響
由圖4可知,隨著鹽脅迫濃度增加,黃蜀葵葉中總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢,且不同濃度的鹽脅迫對黃蜀葵葉中的總黃酮含量影響顯著。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時,黃蜀葵葉中總黃酮含量達到最高值,為0.778%,與CK(0.6%)相比增加297%;當(dāng)鹽脅迫濃度>3 g/L時,黃蜀葵葉中總黃酮含量開始呈下降趨勢,在鹽脅迫濃度為9g/L
(0.416%)時,黃蜀葵葉中總黃酮含量比CK顯著低30.7%。綜上所述,輕度鹽脅迫可以提高黃蜀葵葉中總黃酮含量。在黃蜀葵葉、莖、根中總黃酮含量較低,金絲桃苷的含量利用HPLC法已經(jīng)無法檢出。
2.4鹽脅迫對黃蜀葵莖中總黃酮含量的影響
由圖5可知,黃蜀葵莖中總黃酮含量變化趨勢不明顯。1、3 g/L鹽脅迫下莖中的總黃酮含量與CK相比無顯著性差異,鹽脅迫濃度為7 g/L(0171%)對黃蜀葵莖中總黃酮含量提高幅度相對較大,與CK(0.160%)相比提高了6.9%;與CK相比,最大下降量是鹽脅迫濃度為9 g/L(0.139%)時,下降了13.1%。
2.5鹽脅迫對黃蜀葵根中總黃酮含量的影響
由圖6可知,隨著鹽脅迫濃度增加,黃蜀葵根中總黃酮含量呈先下降后上升的趨勢,與鹽脅迫對黃蜀葵其他部位的影響不同,呈現(xiàn)出低鹽脅迫降低總黃酮含量、高鹽脅迫提高總黃酮含量的現(xiàn)象。在剛開始脅迫時,黃蜀葵根中總黃酮含量有下降的趨勢,在鹽脅迫濃度為3 g/L(0.028%)時,黃蜀葵根中總黃酮含量與CK(0.040%)相比下降了30%;當(dāng)鹽脅迫濃度>3 g/L時,黃蜀葵根中總黃酮含量呈上升趨勢,其中鹽脅迫濃度為7 g/L(0.048%)時,黃蜀葵根中總黃酮含量比CK增加20%。
2.6鹽脅迫對黃蜀葵花抗氧化活性的影響
黃蜀葵花中的黃酮含量明顯高于其他部位,因此,利用黃蜀葵花提取液進行抗氧化試驗,探究鹽脅迫對黃蜀葵抗氧化活性的影響。由表1可知,在T-AOC能力、·OH清除率、DPPH自由基清除率3個抗氧化活性指標(biāo)中,黃蜀葵花醇提液的·OH清除能力最高,而T-AOC能力相對較弱。當(dāng)鹽脅迫濃度在2 g/L時,黃蜀葵花的抗氧化活性最高,T-AOC能力為3.4 U/mL、·OH清除率為98.45%、DPPH自由基清除率8465%;當(dāng)鹽脅迫濃度在3 g/L時,抗氧化活性均最低,此結(jié)果與“2.2”節(jié)中總黃酮含量相一致,其他鹽脅迫濃度組抗氧化活性無明顯規(guī)律,且與總黃酮含量無明顯對應(yīng)關(guān)系。鹽濃度在0~2 g/L 時,隨鹽脅迫濃度升高·OH清除率升高;但鹽脅迫濃度超過3 g/L時,·OH清除率下降。說明高于2 g/L的鹽脅迫濃度會使·OH清除降低。
3結(jié)論與討論
3.1不同部位總黃酮含量
目前,關(guān)于黃蜀葵不同部位總黃酮含量的相關(guān)文獻極少,本試驗比較了黃蜀葵不同部位總黃酮含量。結(jié)果顯示,各部位醇提液中總黃酮含量為花>葉>莖>根,其原因可能是不同生長時期不同部位對總黃酮積累不同。黃蜀葵花中總黃酮含量最高,有極高的利用價值,而黃蜀葵根、莖、葉中總黃酮含量較少,但其可能含有較高的其他功能性物質(zhì),如陳云香等研究發(fā)現(xiàn)黃蜀葵葉和莖中多糖含量很高[11]。黃蜀葵全身是寶,不同部位所含功能物質(zhì)不同,因此黃蜀葵功能產(chǎn)品的開發(fā)更有針對性。
3.2不同部位金絲桃苷含量
在鹽脅迫濃度為2 g/L下,黃蜀葵花中金絲桃苷達到最大值,與CK相比有顯著差異;而金絲桃苷在莖和葉中未檢出,表明金絲桃苷是黃蜀葵花中總黃酮的指標(biāo)性成分。張曉倩等研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NaCl 濃度為0.3%時,金絲桃苷含量達到最大,當(dāng)NaCl濃度為0.7%時,金絲桃苷含量急劇下降,說明鹽脅迫并不能無限制誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物增加,當(dāng)鹽濃度超過一定臨界值,植株遭受鹽害,將影響代謝產(chǎn)物的合成[15]。綜上,低濃度鹽脅迫有利于金絲桃苷的積累。
綜上所述,黃蜀葵不同部位總黃酮含量為花>葉>莖>根。當(dāng)鹽脅迫濃度為2 g/L時,黃蜀葵黃酮含量與金絲桃苷含量均達到最大值,而黃蜀葵根莖葉中金絲桃苷無檢出。黃蜀葵的抗氧化活性規(guī)律與總黃酮含量規(guī)律大致相同,均在鹽脅迫濃度為2 g/L時達到最高,說明在黃蜀葵花中總黃酮起到主要的抗氧化活性。
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基金項目:河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃(編號:16226304D);河北省唐山市科技創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃(編號:18130206B)。
作者簡介:寧亞茹(1992—),女,河北唐山人,碩士,助理研究員,主要從事耐鹽植物研究。E-mail:2501116178@qq.com。
通信作者:王秀萍,研究員,主要從事耐鹽植物高效利用研究。E-mail:bhswxp@163.com。