胡智立 雷期音 賀守第 陳葉

〔摘要〕 目的 探討魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate， SH）通過Th1/Th2平衡對卵白蛋白（ovum albumin， OVA）誘導急性哮喘小鼠模型的影響。方法 實驗用雌性BALB/c小鼠32只隨機分為正常組、模型組、低濃度SH組、高濃度SH組，每組8只，建立OVA誘導急性小鼠哮喘模型后，低濃度SH組、高濃度SH組分別每天腹腔注射10、25 mg/kg SH，正常組、模型組注射等體積的生理鹽水，共14 d。ELISA檢測小鼠血清免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白G1（IgG1）、免疫球蛋白G2a（IgG2a）和脾臟單個核細胞培養(yǎng)上清液白細胞介素-10（IL-10）、干擾素-γ （IFN-γ）濃度;流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟單個核細胞中Th1、Th2比例;qPCR法檢測小鼠脾臟單個核細胞GATA結(jié)合蛋白3（GATA3）、轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）、T盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）mRNA表達水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組血清IgG1濃度，脾臟單個核細胞Th2比例、GATA3、STAT6、T-bet的mRNA表達及上清液IL-10濃度上升，IgG2a濃度水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，SH能降低血清IgG1濃度，脾臟單個核細胞Th2比例、GATA3的mRNA表達及上清液IL-10濃度，提高血清IgG2a濃度、脾臟單個核細胞Th1比例、T-bet的mRNA表達及上清液IFN-γ濃度，呈濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 魚腥草素鈉通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡抑制OVA誘導急性小鼠哮喘的炎癥，可能與調(diào)控GATA3、STAT6、T-bet等轉(zhuǎn)錄因子相關。

〔關鍵詞〕 急性哮喘;魚腥草素鈉;T細胞;卵白蛋白;炎癥;Th1;Th2

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.009

Effect of Sodium Houttuyfonate Regulating T Cell Balance in OVA-induced

Acute Asthma Mouse Model

HU Zhili1， LEI Qiyin2， HE Shoudi3， CHEN Ye1*

（1. Department of Pediatrics， Union Shenzhen Hospital， Huazhong University of Science and Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen， Guangdong 518000， China; 2. Department of Stomatology， Shenzhen Hospital， Southern Medical University， Shenzhen， Guangdong 518000， China; 3. Department of Traditional Chinese Medicine Rheumatology， Huazhong University of Science and Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen， Guangdong 518000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of sodium houttuyfonate （SH） on Th1/Th2 balance in ovum albumin （OVA）-induced acute asthma in mice. Methods The experiment mice were randomly assigned into normal group， model group， low-concentration SH group， and high-concentration SH group， with 8 mice in each group. After the OVA-induced acute mouse asthma model was established， the low-concentration SH group and high-concentration SH group were injected intraperitoneally with 10， 25 mg/kg SH every day， the normal group and model group were given an equal volume of normal saline， also for 14 days. ELISA was used to detect the IgG， IgG1， IgG2a concentrations in the mouse serum and IL-10， IFN-γ concentrations in cell culture supernatant liquid of spleen mononuclear. Flow cytometry was used to detect the Th1 and Th2 ratio of mouse spleen mononuclear cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of GATA3， STAT6， T-bet in mouse spleen mononuclear cells. Results Compared with the normal group， the model group's IgG1 concentration in the serum， the Th2 ratio， mRNA expression of GATA3， STAT6， T-bet and concentration of supernatant IL-10 in spleen mononuclear cell increased， and the IgG2a concentration in the serum decreased， with statistical differences （P<0.01）; compared with the model group， SH can reduce IgG1 concentration in the serum， the Th2 ratio， mRNA expression of GATA3 and concentration of supernatant IL-10 in spleen mononuclear cell， increase IgG2a concentration in the serum， the Th1 ratio， mRNA expression of T-bet and concentration of supernatant IFN-γin spleen mononuclear cell， there was a concentration-dependent and the differences were statistically significant （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion SH can inhibit OVA-induced acute asthma inflammation in mice by regulating the Th1/Th2 balance， which may be related to the regulation of transcription factors such as GATA3， STAT6， and T-bet.

〔Keywords〕 acute asthma; sodium houttuyfonate; T cells; ovalbumin; inflammation; Th1; Th2

哮喘是一種嚴重的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，是最常見氣道疾病之一，成為全球范圍內(nèi)嚴重威脅公眾健康的慢性疾病[1]。近年來，隨著環(huán)境的改變，小兒支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而且目前小兒支氣管哮喘疾病嚴重影響到小兒的生活質(zhì)量，給患者、家屬和醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重的社會和經(jīng)濟負擔[2]。目前，治療哮喘的藥物主要是激素。哮喘屬于中醫(yī)學“喘證”“哮證”的范疇，主要病機為宿痰內(nèi)伏于肺，復感外邪、飲食、情志、勞倦等[3]。

魚腥草是傳統(tǒng)的中草藥，性味幸、微寒，具有清熱解毒的功效，常治療實熱、濕邪等實證肺癰[4]。魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate， SH）是魚腥草素與亞硫酸氫鈉鹽合成。魚腥草素鈉具有殺菌消炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫作用[5]。關于SH對免疫細胞的影響的研究尚未報道，本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，SH能抑制哮喘模型小鼠白細胞介素-4（IL-4）、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）等因子的分泌。因此，本研究擬檢測急性哮喘模型小鼠的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白G1（IgG1）、免疫球蛋白G2（IgG2）水平，白細胞介素-10（IL-10）、干擾素-γ（IFN-γ）濃度以及GATA結(jié)合蛋白3（GATA3）、轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）、T盒子轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）mRNA表達水平，旨在探索SH是否通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡抑制急性哮喘模型的炎癥。

1 材料與方法

1.1? 動物

實驗用雌性BALB/c小鼠32只購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，SPF級，體質(zhì)量（21±2） g。本研究所有動物均在深圳大學醫(yī)學院SPF動物房進行。實驗動物飼養(yǎng)及實驗處理都經(jīng)深圳大學實驗動物福利與倫理委員會審批（倫理號：LW-2020-012）。

1.2? 藥物與主要試劑

SH（批號：1306-5，上海青平藥業(yè)有限公司，純度≥97%）;HRP-goat anti mouse IgG、IgG1、IgG2a抗體（批號分別為6030-05、6010-48、6015-23，美國Southern公司）;Anti-mouse CD4 APC、Anti-mouse IFN-γ FITC、Anti-mouse IL-4 PE（批號分別為12-0040-68、15-0290-63、23-0057-61，美國Ebioscience公司）;小鼠白介素10（IL-10）、γ-干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（批號分別為BMS7267、BMS5424，北京四正柏公司）。

1.3? 主要儀器

ABI7500型實時熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）;51119770型全波長酶標儀Multiskar（美國Thermo公司）;FACSCanto II型流式細胞儀（美國BD biosciences公司）。

1.4? 動物分組、模型制備及干預方法

將BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、低濃度SH組、高濃度SH組，每組8只。除空白組外，其余小鼠按照課題組前期方案造模[3]，第0、3、7天，小鼠背部多點注射100 μg/只的OVA與佐劑氫氧化鋁的乳化劑，第14天起，予50 μg/只OVA滴鼻激發(fā)，建立哮喘模型;藥物干預于造模的第7天起，低濃度SH組、高濃度SH組腹腔分別注射10、25 mg/kg SH（溶于生理鹽水），1 d/次，共14 d。模型組及正常組腹腔注射等體積的生理鹽水，第21天乙醚麻醉處死動物。

1.5? 檢測指標

1.5.1? ELISA法檢測小鼠血清OVA-IgG、IgG1、IgG2濃度? 小鼠眼球取血，離心，收集血清。準備96孔板，包被20 μg/mL OVA于96孔板中，4 ℃過夜，3% BSA/PBS室溫封閉2 h;將小鼠血清1∶20稀釋后，加入96孔板中，37 ℃孵育2 h，洗滌3次，加入HRP-goat anti mouse IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃孵育2 h，PBST溶液洗滌3次后，加入TMB顯色液，加入2 mol/L硫酸終止液。采用酶標儀檢測吸光度值。

1.5.2? 流式細胞術(shù)檢測小鼠Th1、Th2的比例? 流式細胞術(shù)檢測CD4+ T淋巴細胞內(nèi)IFN-γ和IL-4含量，分別反映Th1、Th2細胞的數(shù)量。無菌條件下，從小鼠背面分離出脾臟，加入1 640完全培養(yǎng)基，碾磨后，加入淋巴細胞分離液，放入離心機，常溫，3 000 r/min，離心半徑11 cm，離心30 min，吸取中層渾濁細胞層，洗滌1次，重懸細胞，細胞計數(shù)后，以1×108個/mL加入12孔板;加入細胞刺激劑，培養(yǎng)箱孵育16 h后，取100 μL細胞懸液加入流式管;加入Anti-mouse CD4 APC，4 ℃孵育30 min;1 400 r/min，離心半徑11 cm，離心5 min，加入IC固定液，室溫孵育20 min，洗滌后;加入固定/破膜工作液，避光4 ℃孵育20 min，加入Permeabilization Buffer，室溫孵育15 min，加入anti-mouse-IL-4-PE、anti-mouse-IFN-γ-FITC，4 ℃避光孵育30 min，洗滌，1 400 r/min，離心半徑11cm，離心5min，加入緩沖液重懸細胞，上機檢測，應用流式軟件flowjo 6.0分析。

1.5.3? ELISA檢測小鼠脾臟單個核細胞IL-10、IFN-γ濃度? 取上述分離好的單個核細胞，以1×106個/孔加入24孔板中，加入20 μg/孔OVA，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，收集細胞上清液，1 000 r/min，離心半徑11 cm，離心5 min，采用ELISA法檢測各組細胞上清液IL-4、IFN-γ的水平，具體操作根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，計算IL-4、IFN-γ濃度。

1.5.4? qPCR檢測小鼠OVA刺激脾臟單個核細胞GATA3、STAT6、T-bet的mRNA表達? 根據(jù)primer設計小鼠GATA3、STAT6、T-bet的引物（GATA3：正向引物5-AAGCTCAGTATCCGCTGACG-3，反向引物5-GTTTCCGTAGTAGGACGGGAC-3;STAT6：正向引物5-CTCTGTGGGGCCTAATTTCCA-3，反向引物5-GCATCTGAACCGACCAGGAAC-3;T-bet：正向引物5-GTGACCCAGATGATTGTGCTC-3，反向引物5-GTAGGCAGTCACGGCAATG-3;β-actin：正向引物5-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3，反向引物5-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAG-3），取上述分離好的單個核細胞，采用RNA提取試劑盒提取各組RNA，采用cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA轉(zhuǎn)錄，使用qPCR試劑盒檢測各組GATA3、STAT6、T-bet的mRNA表達，采用算法進行統(tǒng)計。

1.6? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料使用“x±s”表示，若資料滿足正態(tài)分布及方差齊性，采用t檢驗，反之則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a水平比較

與正常組相比，模型組血清IgG、IgG1、IgG2a水平升高（P<0.01）;與模型組比較，低濃度SH組和高濃度SH組IgG1水平降低（P<0.05），IgG2a水平上升（P<0.05）。見表1。

2.2? 各組小鼠脾臟單個核細胞Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）比例比較

與正常組相比，模型組脾臟單個核細胞Th2（IL-4）比例升高（P<0.01）;與模型組比較，低濃度SH組和高濃度SH組Th1（IFN-γ）比例、Th1（IFN-γ）/Th2（IL-4）上升（P<0.01），Th2（IL-4）比例下降（P<0.01）。見圖1和表2。

2.3? 各組小鼠脾臟細胞上清液IL-10、IFN-γ濃度比較

與正常組相比，模型組脾臟單個核細胞上清液IL-10顯著增加（P<0.01），IFN-γ無顯著變化（P>0.05）;與模型組比較，低濃度SH組和高濃度SH組IFN-γ水平上升（P<0.01），IL-10水平下降（P<0.01）。見圖2。

2.4? 各組小鼠脾臟單個核細胞GATA3、STAT6、T-bet的mRNA表達水平比較

與正常組相比，模型組脾臟單個核細胞GATA3、STAT6、T-bet的mRNA表達上升（P<0.01）。與模型組比較，低濃度SH組脾臟單個核細胞GATA3 mRNA表達下降（P<0.05），STAT6 mRNA表達水平無明顯變化（P>0.05），T-bet的mRNA表達上升（P<0.01）;高濃度SH組脾臟單個核細胞GATA3 mRNA、STAT6 mRNA表達下降（P<0.01），T-bet mRNA表達上升（P<0.01）。見圖3。

3 討論

魚腥草為中國的傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、消癰排膿的作用。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，魚腥草制劑和提取物及單體具有抗炎作用，能減少或抑制TNF-α、IL-4、IL-10等炎癥因子，而魚腥草水蒸氣提取物能通過上調(diào)IFN-γ的表達減輕肺纖維化，可能與抑制促進STAT1通路有關[9]，說明魚腥草的成分具有調(diào)節(jié)炎癥因子分泌的功能。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SH能抑制哮喘IL-4、MCP-1的分泌[6]，本研究進一步發(fā)現(xiàn)其能抑制IL-10的分泌，促進IFN-γ分泌上調(diào)，因此，推測魚腥草調(diào)節(jié)炎癥因子的主要成分可能是魚腥草素。

人體免疫T細胞分為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞，CD4+ T細胞中Th1、Th2細胞的失衡與哮喘的免疫反應具有相關性[10]，Th1細胞分泌IFN-γ、TNF-α，是抵抗細菌、病毒的主要因子，同時參與自身免疫紊亂疾病，Th1細胞誘導B細胞產(chǎn)生IgG2a抗體[11-12];Th2細胞通過分泌IL-4、IL-10參與變態(tài)免疫反應疾病及抵抗寄生蟲感染，誘導B細胞產(chǎn)生IgG1抗體[13]。哮喘的重要免疫異常機制是Th1/Th2失衡，當Th2功能亢進時，促進IgE、IL-4、IL-10合成，加重哮喘的病情。GATA3、STAT6、T-bet等基因在T細胞的分化中起關鍵作用[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)低、高濃度SH能抑制IgG1和IL-10的水平，上調(diào)IgG2a、IFN-γ的水平，說明SH抑制哮喘模型炎癥模型可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡有關，我們通過流式細胞術(shù)進一步驗證發(fā)現(xiàn)SH能抑制Th2細胞比例，上調(diào)Th1細胞的比例，且Th1/Th2向Th1轉(zhuǎn)化。關于調(diào)控Th1/Th2轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子研究中，文獻報道GATA3、STAT6是參與Th2分化誘導的主要轉(zhuǎn)錄因子，可促進Th2細胞增殖和產(chǎn)生IL-4、IL-13等Th2細胞因子，使Th1/Th2比例失衡[17-18]。T-bet是T-box基因家族的新型轉(zhuǎn)錄因子，選擇性地表達于Th1細胞，能誘導干擾素γ的產(chǎn)生，在Th1細胞的分化中起決定性的作用[19]，我們研究發(fā)現(xiàn)SH能調(diào)節(jié)T細胞中Th1，Th2的比例，我們進一步檢測與Th1、Th2相關的轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、STAT6，發(fā)現(xiàn)SH能抑制轉(zhuǎn)錄因子GATA3、STAT6的表達，促進T-bet表達上調(diào)，我們猜測SH可能通過調(diào)控GATA3、STAT6、T-bet調(diào)控T細胞分化。

魚腥草素來源于魚腥草，常用于治療中醫(yī)“熱哮”的肺熱壅盛的證候?！盁嵯敝饕憩F(xiàn)為喉中哮鳴，面赤口苦，舌質(zhì)紅，苔黃膩，治療以清熱宣肺、化痰定喘為法，“熱哮”在西醫(yī)屬于急性發(fā)作期哮喘。OVA誘導小鼠急性哮喘模型用作為中醫(yī)發(fā)作性“哮證”模型[15]，本實驗使用OVA誘導急性哮喘小鼠模型，間接模擬熱哮的證型，通過SH抑制OVA誘導急性哮喘小鼠模型的炎癥的實驗研究，進一步為魚腥草治療“熱哮”提供理論依據(jù)。

綜上所述，SH通過調(diào)節(jié)調(diào)控T淋巴細胞Th1/Th2平衡抑制急性哮喘的炎癥，可能與調(diào)控GATA3、STAT6、T-bet等轉(zhuǎn)錄因子相關。

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