馬明蔥，李曉雨，卓 超

(1. 東莞市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 東莞 523000； 2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510000)

肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性桿菌，可引起多系統(tǒng)感染[1]。與經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicKlebisellapneumonia，CKP)相比，高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKp)受到廣泛關(guān)注，不僅可引起細(xì)菌性肝膿腫[2]，還可引起腦膜炎、壞死性筋膜炎和眼內(nèi)膜炎等轉(zhuǎn)移性感染[3-4]。hvKp菌株在瓊脂平板上的菌落表現(xiàn)為高黏液性(hypermucoviscous，hm)[5]，可引起嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性感染[6]。但也有小鼠試驗(yàn)表明，僅少數(shù)(1/5)高黏液表型菌株表現(xiàn)為高毒力[7]。因此，不能僅以高黏液表型區(qū)分hvKp與CKP菌株。研究高黏液表型以及基因型預(yù)測hvKp的可靠性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 2016年11月—2018年4月廣東省4所醫(yī)院收集多種標(biāo)本(包括血液、引流液、尿等)來源的肺炎克雷伯菌。將收集的菌株應(yīng)用Vitek全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定。初次鑒定后再經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定。

1.2 拉絲試驗(yàn) 用接種環(huán)蘸取生長在LB(購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)瓊脂平板上的新鮮肺炎克雷伯菌菌落，將接種環(huán)向上提起，若菌落形成的黏絲長度>5 mm，則判定為拉絲試驗(yàn)陽性，稱為高黏液表型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiellapneumoniae，hmKp)；反之則為陰性，稱為非高黏液表型肺炎克雷伯菌(non-hypermucoviscousKlebsiellapneumoniae，non-hmKp)[5]。

1.3 血清莢膜分型與毒力基因檢測 采用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR擴(kuò)增特異性引物(血清型K1、K2、K5、K20、K54、K57及毒力基因rmpA、rmpA2、magA、iucA等18個(gè)毒力基因)參照文獻(xiàn)[8]合成。PCR體系：PCR上下游引物(引物濃度10 pmol/μL)各1.0 μL，Premix 12.5 μL(購自北京六合華大基因科技有限公司)，超純水9.5 μL，DNA模板1.0 μL，總共25.0 μL。PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙脫氧末端終止法(也稱sanger測序法)測序，GenBank 進(jìn)行 Blast 比對雙測序結(jié)果，進(jìn)而獲得相應(yīng)基因型。

1.4 蠟螟試驗(yàn) 從天津惠裕德生物科技有限公司購買符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的大蠟螟幼蟲，每只重約300～400 mg，膚色不正常或活力欠佳的幼蟲均剔除在外。為減少物理損傷及自身原因，共設(shè)置2組對照組，一組注射等量的PBS，一組蠟螟不做任何處理。收集孵育于LB瓊脂平板上18～20 h分純的臨床肺炎克雷伯菌菌株，將單菌落加入PBS溶液(pH=6.5)調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，依照菌落計(jì)數(shù)結(jié)果將菌液濃度稀釋至104～107CFU/mL。隨機(jī)選擇10只大蠟螟為一組，每一株肺炎克雷伯菌共注射3組，每株菌4個(gè)稀釋濃度共需120只蠟螟，每株待檢細(xì)菌均進(jìn)行試驗(yàn)。取微量注射器吸取20.0 μL細(xì)菌懸液從蠟螟偽足的第一腹節(jié)進(jìn)針，全部注入后置于干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)放入孵箱，培養(yǎng)皿上標(biāo)記細(xì)菌名稱及濃度。注射后每隔6 h觀察記錄每組蠟螟死亡數(shù)量，直到72 h，72 h后大蠟螟做滅菌無害化處理。用回歸分析方法中的probit概率法計(jì)算半數(shù)致死率(LD50)(log10 CFU/mL)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，各組LD50比較采用t檢驗(yàn)或單因素分析[9]，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 拉絲試驗(yàn)結(jié)果 共收集194株肺炎克雷伯菌，主要來源于血標(biāo)本(占70.1%)，其次為引流液(11.4%)、下呼吸道標(biāo)本(10.8%)、尿(3.6%)、無菌體液(3.1%)、腦脊液(1.0%)。所有菌株拉絲試驗(yàn)陽性率為40.2%(78/194)，其中血標(biāo)本來源菌株陽性率為33.1%(45/136)，其他標(biāo)本來源菌株陽性率為56.9%(33/58)。

2.2 血清分型結(jié)果 194株中有82株(42.3%)肺炎克雷伯菌可進(jìn)行莢膜血清型分型，112株(57.7%)用PCR方法無法獲得確切血清型(非K1/K2/K5/K20/K54/K57)。hmKp與non-hmKp菌株的莢膜血清型比較，hmKp菌株中血清型K1、K2、K57檢出率高于non-hmKp菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。hmKp與non-hmKp菌株中血清型K5、K20、K54檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且檢出率均較低。見表1。

表1 hmKp和non-hmKp菌株血清型分布情況

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 檢測78株hmKp菌株的毒力基因，其中5個(gè)毒力基因檢出率超過80%，分別為ureA(93.6%)、fimH(88.5%)、iroB(87.2%)、entB(84.6%)、iucA(82.1%)；iroB+fimH基因檢出率為80.8%(63株)，entB+fimH基因檢出率為79.5%(62株)，iucA+iroB基因檢出率為78.2%(61株)，iucA+iroB+fimH基因檢出率為74.4%(58株)，iucA+iroB+peg-344基因檢出率為71.8%(56株)。hmKp菌株中fimH、iroB、entB、iucA、rmpA、rmpA2、peg-344、ycfM、Irp-2、ybts、kfuB、uge、magA檢出率高于non-hmKp菌株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

2.4 蠟螟試驗(yàn)結(jié)果 hmKp菌株LD50低于non-hmKp菌株，血清型K1菌株LD50高于血清型K2菌株。根據(jù)菌株毒力基因陽性和陰性進(jìn)行分組，對比各組蠟螟LD50，發(fā)現(xiàn)僅iucA、iroB、fimH毒力基因陽性菌株LD50低于相應(yīng)的陰性菌株。見表3。iucA+iroB+imH基因均陽性菌株LD50低于均陰性菌株[LD50分別為(5.4±0.7)、(5.8±0.6)log10 CFU/mL，P=0.004]。3個(gè)基因(iucA、iroB、fimH)均陽性與其中任意兩個(gè)基因陽性或一個(gè)基因陽性LD50比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。將iucA+iroB+fimH全陽性、iucA+iroB+fimH全陰性菌株分為兩組，結(jié)合高粘液表型(hm陽性/hm陰性)，比較毒力基因與高黏液表型預(yù)測hvKp的準(zhǔn)確性。iucA陰性+iroB陰性+fimH陰性+hm陽性組(n=2)菌株數(shù)較少，無法對比，因此共分為三組，分別為iucA+iroB+fimH+hm全陽性組(n=58)、iucA陽性+iroB陽性+fimH陽性+hm陰性組(n=23)、iucA+iroB+fimH+hm全陰性組(n=28)， 其LD50分別為(5.39±0.71)、(5.44±0.62)、(5.83±0.64)log10 CFU/mL，總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.157，P=0.018)，前兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值為0.786)，但前兩組分別與第3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.006、0.041)。iucA+iroB+fimH 3個(gè)毒力基因陽性的情況下，是否為高黏液表型菌株的LD50比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對于非高黏液表型菌株，iucA+iroB+fimH 3個(gè)毒力基因陽性菌株的LD50低于相應(yīng)陰性菌株。

表2 hmKp和non-hmKp菌株毒力基因檢出情況

表3 不同組肺炎克雷伯菌感染蠟螟的LD50 比較

3 討論

2016年11月—2018年4月從廣東省4所醫(yī)院收集的肺炎克雷伯菌中，來源于血標(biāo)本者有33.1%為拉絲試驗(yàn)陽性，與北京兩家單中心研究的血流感染中hvKp(拉絲試驗(yàn)陽性的菌株定義為hvKp)的比率相近(分別為33.0%、31.4%)[10-12]，但高于西班牙(6.0%)，加拿大(8.2%)等地區(qū)[5]。若依據(jù)拉絲試驗(yàn)陽性和iucA基因陽性定義hvKp，本研究中hvKp的比率為40.2%，低于我國兩所教學(xué)醫(yī)院中老年患者中hvKp的比率(47.5%)[13]，不排除與本研究中標(biāo)本來源較多有關(guān)。若依據(jù)基因背景(rpmA+iucA)定義hvKp，本研究中血流感染hvKp的比率為24.3%，與我國血流感染中hvKp 24.5%的比率相似[14]。在本研究中，依據(jù)拉絲試驗(yàn)和毒力基因型定義hvKp與僅拉絲試驗(yàn)定義的比例相近，因此，對于流行病學(xué)研究或者臨床病例初篩，應(yīng)用拉絲試驗(yàn)初篩hvKp是可取的?？偟膩碚f，無論依據(jù)何種方法定義hvKp，本研究中廣東地區(qū)hvKp的比例與我國其他地區(qū)差異不大。蠟螟試驗(yàn)結(jié)果表明，hmKp菌株的平均毒力強(qiáng)于non-hmKp菌株，此結(jié)果與Russo等[15]2012年采用小鼠模型進(jìn)行相關(guān)研究的結(jié)果一致。但并非所有hmKp菌株的毒力均高于non-hmKp菌株，尚有non-hmKp菌株的毒力較強(qiáng)，表明存在其他因素影響肺炎克雷伯菌的毒力，僅依據(jù)高黏液表型定義hvKp是不可取的，但可以作為hvKp菌株的初步篩查。鐵載體腸桿菌素(entB)、氣桿菌素(iucA)、沙門菌素(iroB)、耶爾森菌素(ybts,irp-2)、kfuB等均介導(dǎo)三價(jià)鐵的攝取，均是肺炎克雷伯菌感染的重要毒力因子[11]。Hsieh等[16]2008年的小鼠模型研究表明，與iucA陰性菌株相比，iucA陽性菌株可使小鼠模型的毒力增加，本研究中蠟螟模型的毒力研究結(jié)果與此一致。除此之外，還發(fā)現(xiàn)iroB+、fimH+陽性菌株的毒力強(qiáng)于相應(yīng)的陰性菌株，并且不受高黏液表型的影響，表明鐵載體系統(tǒng)和纖毛對于肺炎克雷伯菌毒力的重要性。

rmpA/rmpA2調(diào)節(jié)胞外脂多糖的合成，與高黏液表型密切相關(guān)，也認(rèn)為是hvKp的重要生物標(biāo)記物[10]，但本研究高黏液表型中僅66.7%的菌株rmpA陽性，并且rmpA/rmpA2的陽性菌株與陰性菌株的毒力無明顯差異，除與本研究中菌株來源較多有關(guān)外，也提示可能存在其他機(jī)制調(diào)節(jié)高黏液表型的表達(dá)[10]。

綜上所述，本研究表明僅依據(jù)拉絲試驗(yàn)陽性檢測預(yù)測hvKp準(zhǔn)確性較低，毒力基因iucA+/iroB+/fimH+對預(yù)測hvKp有一定的意義。