龍華婧，邱芳華，劉道利，周 意，吳嘉怡，何仰芬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣州中醫(yī)醫(yī)院 1. 檢驗(yàn)科； 2. 院感科，廣東 廣州 510000)

亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類藥物對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及頭孢菌素酶(AmpC)具有高度穩(wěn)定性，且由于抗菌藥物后效應(yīng)使其具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣的特性，被認(rèn)為是治療腸道桿菌所致重度感染的最后一道防線[1]。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用、不合理應(yīng)用，以及質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶流行，耐藥基因通過質(zhì)粒在細(xì)菌間傳播及變遷[2-3]，導(dǎo)致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbape-nem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)已呈全球散布[4]。根據(jù)全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)結(jié)果報(bào)道，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2014年的4.8%、4.5%上升到2019年的10.5%、10.9%，五年間上升幅度達(dá)2倍以上[5-6]，耐藥率上升快速。本研究對2017—2019年CRKP相關(guān)檢索文獻(xiàn)中大量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討近年來CRKP在我國流行的克隆及分子流行病學(xué)特征，為臨床上追蹤及實(shí)時(shí)監(jiān)控CRKP醫(yī)院感染以及防控提供實(shí)際數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 通過計(jì)算機(jī)檢索中國知網(wǎng)(CNKI)和萬方期刊數(shù)據(jù)庫，檢索發(fā)表時(shí)間為2017年1月1日—2019年12月31日，檢索詞包括耐碳青霉烯類、肺炎克雷伯菌、耐藥和基因。

1.2 文獻(xiàn)納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)可獲得全文的公開發(fā)表期刊論文、學(xué)位論文；(2)文獻(xiàn)所研究的肺炎克雷伯菌株在中國境內(nèi)采集，且有具體收集地點(diǎn)；(3)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可提供菌株采集地，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測耐藥基因，通過多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析獲得ST型別。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重復(fù)報(bào)道的文獻(xiàn)；(2)綜述、病例報(bào)告、會議或不能獲取全文等文獻(xiàn)；(3)文獻(xiàn)僅提供菌株藥敏分析而不能提供PCR檢測的耐藥基因或MLST的ST型別。

1.3 數(shù)據(jù)提取及分析 根據(jù)巴斯德研究所網(wǎng)站(https://bigsdb.pasteur.fr/)提供的肺炎克雷伯菌MLST數(shù)據(jù)庫(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef)，將所收集文獻(xiàn)菌株的ST型別進(jìn)行比對，獲得各型別的七個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)，將所有菌株位點(diǎn)信息錄入BioNumerics(Version7.6.3)軟件創(chuàng)建最小生成樹。應(yīng)用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)分析并構(gòu)建相對應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 納入文獻(xiàn) 初步檢索文獻(xiàn)202篇，根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，下載閱讀全文并手工歸納，最終納入40篇文獻(xiàn)[7-46]。共2 094株CRKP，來自全國15個(gè)省市，其中2 094株(100%)通過PCR檢出耐藥基因，859株(41.02%)通過MLST檢出ST型別。根據(jù)中國七大自然地理分區(qū)，本研究暫未納入來自西北及港澳臺地區(qū)的CRKP研究數(shù)據(jù)。

2.2 耐藥基因及亞型檢出情況 提取2 094株CRKP數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，1 631株(77.89%)CRKP攜帶產(chǎn)KPC酶耐藥基因，檢出亞型主要為KPC-2型(1 014株)；916株(43.74%)CRKP攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因，其中攜帶CTX-M型280株，TEM型270株，SHV型366株。215株(10.27%)CRKP攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶及亞胺培南(IMP)酶耐藥基因，其中攜帶產(chǎn)NDM型130株，檢出亞型主要為NDM-1(45株)；攜帶產(chǎn)IPM型78株，檢出亞型主要為IMP-4(22株)；攜帶產(chǎn)VIM型7株。80株(3.82%)CRKP攜帶AmpC酶耐藥基因，其中攜帶FOX 28株，DHA 45株，CMY7株；4株(0.19%)CRKP攜帶OXA酶耐藥基因，其中2株為OXA-48亞型；97株(4.63%)CRKP攜帶喹諾酮類耐藥基因。見表1。

表1 2 094株CRKP耐藥基因及亞型的檢出情況

2.3 耐藥基因的地區(qū)分布 2 094株CRKP共檢出12種耐藥基因，其中KPC在各地區(qū)占比均最高，東北、華北、華東、華南、華中、西南地區(qū)分別為72.73%、92.11%、84.27%、69.39%、62.86%、91.53%。華中地區(qū)CRKP攜帶CTX-M(50.00%)、TEM(35.19%)、SHV(51.46%)、qnrS(23.54%)耐藥基因高于其他地區(qū)。見表2。

表2 2 094株CRKP耐藥基因的地區(qū)分布情況[株(%)]

2.4 ST型別檢出情況 859株CRKP菌株進(jìn)行MLST，共檢出82個(gè)ST型，其中優(yōu)勢型別為ST11(76.72%)，其次為ST15(2.44%)、ST76(1.86%)、ST23(1.28%)。見圖1。

圖1 859株CRKP的ST型別檢出比例

2.5 ST型別地區(qū)分布 859株CRKP菌株經(jīng)MLST分型，共分為82種ST型，優(yōu)勢型別為ST11(3-3-1-1-1-1-4)；65種ST型只分布在1個(gè)地區(qū)，11種ST型分布于2個(gè)地區(qū)，3種ST型分布于3個(gè)地區(qū)，1種ST型分布于4個(gè)地區(qū)，1種ST型分布于6個(gè)地區(qū)。見圖2。

2.6 耐藥基因與ST分型的相關(guān)性 共581株CRKP攜帶產(chǎn)KPC-2酶耐藥基因且MLST為ST11,占總ST11型別(共659株)的88.16%。見表3。

表3 耐藥基因與ST型別的關(guān)系[株(%)]

注：圖中每一個(gè)圈代表一個(gè)ST型,圈的大小代表該ST型所包含的菌株數(shù)，位點(diǎn)差異個(gè)數(shù)不同影響連接線由粗至細(xì)、由實(shí)至虛，最粗實(shí)線位點(diǎn)差異個(gè)數(shù)為1，以此類推。

3 討論

本研究納入CRKP菌株使用PCR方法或MLST的文獻(xiàn)，分析碳青霉烯類耐藥基因以及菌株變異情況，探討CRKP菌株的分子分型和種群結(jié)構(gòu)特征。CRKP耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，研究[5,47-48]表明，CRKP主要耐藥機(jī)制為主動外排機(jī)制活躍，膜孔蛋白突變或缺失致外膜通透性降低，青霉素結(jié)合蛋白作用位點(diǎn)對碳青霉烯類親和力改變，以及碳青霉烯酶的產(chǎn)生等。CRKP經(jīng)碳青霉烯類抗生素臨床治療無效后，其耐藥基因更易通過整合子、轉(zhuǎn)座子等元件在細(xì)菌間進(jìn)行傳播，從而引起耐藥菌株暴發(fā)流行[49]。CRKP菌株進(jìn)行基因序列測定及同源性研究，對耐藥菌株的克隆散播及醫(yī)院感染的監(jiān)測、防控均有非常重要的意義。

本研究創(chuàng)新之處在于統(tǒng)計(jì)分析3年CRKP相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)我國CRKP主要流行的耐藥基因型為KPC-2(62.17%)，且在全國各地區(qū)占比均為最多，主要優(yōu)勢序列型別為ST11型(76.72%)，在全國6個(gè)地區(qū)均有分布，與以往研究[50]結(jié)果相符，且有相關(guān)研究[51-53]報(bào)道此克隆菌株曾引起過醫(yī)院感染的暴發(fā)。產(chǎn)KPC-2的ST11型CRKP菌株[54-56]在我國流行，且近年來逐漸被重視。既往研究[57-58]對單株CRKP菌株進(jìn)行全基因組測序，闡明產(chǎn)KPC-2的ST11型CRKP的基因序列；另一項(xiàng)研究[59]對一株ST11型CRKP菌株進(jìn)行Illumina結(jié)合MinION的全基因組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于IS26作用在一個(gè)IncR/IncF質(zhì)粒上共存3個(gè)blaKPC-2基因，IS26的多個(gè)拷貝可介導(dǎo)耐藥基因的增殖，產(chǎn)生復(fù)雜的耐藥基因遺傳背景。已有研究[60]表明，IS26參與了blaKPC的傳播和擴(kuò)增；且耐碳青霉烯的高毒性肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)更易產(chǎn)生KPC-2的ST11型克隆菌株，高毒力傳播迅速，耐藥基因很可能演變成高毒質(zhì)粒[61]。

雖然對產(chǎn)KPC-2的ST11型CRKP耐藥基因的研究不斷深入，但耐藥基因的散播流行迅速，據(jù)本研究顯示攜帶此基因的耐藥菌株已遍布全國6個(gè)地區(qū)?，F(xiàn)階段對CRKP的綜合防控應(yīng)建立多重耐藥實(shí)時(shí)監(jiān)測體系，臨床嚴(yán)格執(zhí)行抗菌藥物應(yīng)用指征，做到規(guī)范合理使用抗菌藥物，提高醫(yī)務(wù)人員醫(yī)院感染防控意識，嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生，加強(qiáng)無菌操作培訓(xùn)等措施，避免CRKP在醫(yī)院內(nèi)出現(xiàn)暴發(fā)流行。