李亞嬌，孫國(guó)琴，郭九峰，王海燕，于傳宗，龐 杰

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注健康飲食，養(yǎng)生已成為現(xiàn)代人追求的生活方式，食用菌不僅味道清鮮、營(yíng)養(yǎng)豐富且具有藥食同源的功效，其加工產(chǎn)品也已成為人們青睞的綠色、健康食品，深受?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注，因此，食用菌的資源及種質(zhì)開(kāi)發(fā)存在巨大的市場(chǎng)潛力[1-3]。目前，生物技術(shù)在食用菌領(lǐng)域應(yīng)用方面已取得了很大進(jìn)步，尤其是原生質(zhì)體技術(shù)為食用菌菌種改良、新品種選育、野生種馴化的研究提供了一個(gè)十分重要的基礎(chǔ)性方法[4-5]。與自然育種、雜交育種、誘變育種等相比，利用原生質(zhì)體的生物學(xué)特性進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種，具有優(yōu)勢(shì)[6-8]。脫掉細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體，解除了菌株間物理上、生理上的屏障，實(shí)現(xiàn)了種間、屬間及科間遠(yuǎn)緣融合進(jìn)行染色體交換、重組，最后經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子[9-11]，從而有目的地選育具有突出優(yōu)良性狀的新菌株和進(jìn)行野生菌馴化，以滿足生產(chǎn)需要、社會(huì)需求。盡管基因工程和基因編輯領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但原生質(zhì)體融合技術(shù)在生物育種和種質(zhì)創(chuàng)新方面仍然具有不可替代的優(yōu)勢(shì)和地位，筆者就原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌育種方面取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步挖掘其科研生產(chǎn)潛力提供指導(dǎo)。

1 原生質(zhì)體的制備與再生

原生質(zhì)體制備與再生易受選取材料和外界條件的影響，要想獲得最佳的制備和再生條件，需要對(duì)各因素進(jìn)行綜合研究。

1.1 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體是指含有該物種的全部遺傳物質(zhì)，且在外力的作用下被脫掉細(xì)胞壁的細(xì)胞[12]。原生質(zhì)體融合的第一步為原生質(zhì)體制備，早期運(yùn)用機(jī)械、超聲等物理方法進(jìn)行原生質(zhì)體制備，效果欠佳。直到1972年DE VRIES 等[13]成功地利用酶解法分離得到裂褶菌原生質(zhì)體，1981年食用菌脫壁酶問(wèn)世，原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌上的應(yīng)用才有了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[14-16]。食用菌屬于絲狀真菌，且不同種類(lèi)的食用菌細(xì)胞壁成分存在差異，即原生質(zhì)體制備條件因食用菌的種類(lèi)不同而不同。酶解時(shí)間、酶解溫度、穩(wěn)滲劑種類(lèi)及濃度、酶解pH 值、食用菌種類(lèi)、菌齡、酶濃度等因素都影響活性原生質(zhì)體的釋放。李春霞等[17]通過(guò)單因素篩選試驗(yàn)，得到真姬菇原生質(zhì)體的最佳酶解條件為酶解溫度32 ℃、酶解時(shí)間3.5 h、滲穩(wěn)劑0.6 mol/L甘露醇、溶壁酶濃度20 mg/mL，原生質(zhì)體數(shù)量最大可達(dá)到6.75×106個(gè)/mL。春霞[18]以草原黑蘑hm8124-1（菌蓋棕色）、草原蘑菇hm910（菌蓋白色）兩個(gè)菌株搖培8 d 的菌絲體為試驗(yàn)材料制備原生質(zhì)體，當(dāng)溶壁酶濃度為1.4%，25 ℃ 酶解4 h，可以制備足夠的原生質(zhì)體。王金斌等[19]以褐色雙孢蘑菇棕秀一號(hào)為試驗(yàn)材料，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行二次回歸分析，對(duì)褐色雙孢蘑菇制備原生質(zhì)體的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，原生質(zhì)體最佳制備條件為1.35%溶壁酶+7.01%蝸牛酶、酶解溫度30.4 ℃、菌絲體菌齡8.36 d、酶解時(shí)間3 h，在此條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)4.39×107個(gè)/mL。婁海偉等[20]探究蛹蟲(chóng)草單核芽生孢子的原生質(zhì)體制備條件，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，蛹蟲(chóng)草原生質(zhì)體最適制備條件為溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.06%、酶解溫度26.1 ℃、酶解時(shí)間2.57 h，在此條件下，原生質(zhì)體得率的預(yù)測(cè)值為8.97×106個(gè)/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)所得原生質(zhì)體得率為（9.17±0.29）×106個(gè)/mL，預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值差異不顯著，回歸模型擬合良好。宋天磊[21]對(duì)桑黃原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行初步探索，發(fā)現(xiàn)桑黃菌絲體細(xì)胞壁在溶壁酶濃度為2%，25～30 ℃條件下酶解3 h 可達(dá)到較好的脫掉細(xì)胞壁效果，且原生質(zhì)體的產(chǎn)量與菌齡沒(méi)有明顯的線性關(guān)系。

1.2 原生質(zhì)體的再生

原生質(zhì)體再生是指生物體（微生物或植物）細(xì)胞由原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，直至形成菌或植株的過(guò)程，食用菌原生質(zhì)體的再生率受再生培養(yǎng)基成分、pH 值、滲透壓穩(wěn)定劑的容量和種類(lèi)等因素影響。馮婷婷等[22]采取單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)影響蟹味菇原生質(zhì)體再生條件的主要因素：菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)、溶壁酶濃度和酶解時(shí)間進(jìn)行篩選與優(yōu)化，單因素試驗(yàn)表明，原生質(zhì)體最佳再生條件為菌齡6 d，滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L 甘露醇，溶壁酶濃度為2%，酶解3 h；響應(yīng)面法表明，0.6 mol/L 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，最佳再生條件為菌齡7 d，溶壁酶濃度為2%，酶解4 h。白靜瑩等[23]分析不同葡萄糖濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 及不同pH 值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 對(duì)暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體再生率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)其他試驗(yàn)條件一定，葡萄糖濃度為30 mg/mL 時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高，為23.67%；當(dāng)其他試驗(yàn)條件一定，pH 值為7 時(shí)，原生質(zhì)體再生率最高，為19.33%。鄒彰毅等[24]以姬松茸JS01 為試驗(yàn)材料，對(duì)姬松茸原生質(zhì)體的再生條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，菌齡6 d，以0.6 mol/L MgSO4作滲透壓穩(wěn)定劑，溶壁酶濃度2.0%，酶解溫度30 ℃，酶解時(shí)間3 h，pH 值6.5，再生培養(yǎng)基為GM 時(shí)，原生質(zhì)體的再生率最高，為1.12%。再生培養(yǎng)基中添加纖維二糖和VB1后，再生率為1.17%，較優(yōu)化結(jié)果提高了4.46%；首次通過(guò)在再生培養(yǎng)基中添加細(xì)胞壁前體物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)因子，進(jìn)一步提高姬松茸原生質(zhì)體的再生率。崔曉等[25]采用正交試驗(yàn)法探究影響秀珍菇原生質(zhì)體制備和再生的條件，對(duì)菌齡等7 個(gè)單因素、4 個(gè)復(fù)合因素條件和接種方式進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，秀珍菇菌絲在改良液體PD 培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)5 d，以0.6 mol/L 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，2.5%溶壁酶在30 ℃條件下水浴4 h，得到的原生質(zhì)體濃度最大，為4.23×107個(gè)/mL；在TB3 再生培養(yǎng)基中采用單層混菌法接種原生質(zhì)體，再生率最大，為2.35%。

2 原生質(zhì)體融合

1965年，Strunk 第1 次在采絨革蓋菌中制備出原生質(zhì)體，同時(shí)觀察到自發(fā)性融合現(xiàn)象，以此為開(kāi)端，原生質(zhì)體融合技術(shù)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注并迅速發(fā)展[26-28]。原生質(zhì)體融合技術(shù)在食用菌育種的應(yīng)用上發(fā)揮著舉足輕重的作用，跨種、跨屬、跨科的融合也取得進(jìn)展。原生質(zhì)體融合有自發(fā)融合和誘導(dǎo)融合兩種情況，前者融合比較困難，融合率極低，無(wú)法應(yīng)用于試驗(yàn)研究；后者則需要通過(guò)人為干預(yù)融合，融合率顯著高于自發(fā)融合，誘導(dǎo)融合主要有生物融合法、化學(xué)融合法和物理融合法。

2.1 生物融合法

早在20 世紀(jì)60年代，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)一些紫外線滅活的病毒膜片能使細(xì)胞間產(chǎn)生凝聚和融合，如仙臺(tái)病毒1653 曾主要應(yīng)用于細(xì)胞工程中的細(xì)胞融合技術(shù)，在病毒的外殼作用下直接產(chǎn)生這種細(xì)胞膜的融合，但此方法存在一定的不安全性、融合率低、操作較復(fù)雜，目前只在動(dòng)物細(xì)胞融合中使用，未在食用菌原生質(zhì)體融合領(lǐng)域采用[29-30]。

2.2 化學(xué)融合法

化學(xué)融合法始于20 世紀(jì)70年代，是比較常用的融合方法，原理是利用某種化學(xué)物質(zhì)作用于原生質(zhì)體，改變其細(xì)胞膜電位，發(fā)生細(xì)胞聚集，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使細(xì)胞膜融合，從而提高融合率[31]。常用的促融劑有聚乙二醇（PEG）、蟹合劑和二甲亞砜等，聚乙二醇促融劑最為常用。聚乙二醇法不僅對(duì)儀器設(shè)備要求不高，而且操作簡(jiǎn)單、方便，但也存在缺點(diǎn)，聚乙二醇作為促融劑不好把握原生質(zhì)體聚集成團(tuán)的程度，還會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生一定毒性，這樣原生質(zhì)體容易受到損傷或損失，從而影響原生質(zhì)體的再生率和融合率[32]。

化學(xué)融合法在食用菌原生質(zhì)體融合技術(shù)中應(yīng)用廣泛。陳小紅等[33]以茯苓和靈芝為親本菌株，探究出其原生質(zhì)體融合的最佳條件為25%PEG4000、pH 值8.5、在35 ℃下融合20 min，獲得了可使RB-PDA平板穩(wěn)定變色的融合菌株，通過(guò)分子鑒定其主要具有茯苓的遺傳性狀，與靈芝的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但具備部分靈芝的遺傳性狀。王波[34]以白色金針菇菌株3W4 和白色金針菇菌株FMY1203 為親本，將雙親原生質(zhì)體分別進(jìn)行熱滅活（60 ℃，3 min）和化學(xué)滅活（2%EMS）處理后等量混合離心，加入融合劑（40%PEG，0.05 mol/L CaCl2）進(jìn)行融合處理，獲得84 個(gè)再生菌株，且與親本具有拮抗；ISSR 分子標(biāo)記分析表明，融合子與親本存在明顯差異。李麗君[35]選用黑色羊肚菌菌株M10（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的梯棱羊肚菌川羊肚菌1 號(hào)）和M20（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)保存出菇品質(zhì)良好、產(chǎn)量較高的六妹羊肚菌）作為原生質(zhì)體融合的親本，在30 ℃水浴中以30%的PEG-CaCl2為助溶劑融合20 min，獲得6 株生長(zhǎng)勢(shì)較好的羊肚菌菌株，將其與親本進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速度比較與出菇試驗(yàn)，選育出2 株高產(chǎn)菌株R5 和R8。

2.3 物理融合法

物理融合法稍晚于化學(xué)融合法，于20 世紀(jì)80年代前后出現(xiàn)，具有可控制融合條件、無(wú)毒害、操作簡(jiǎn)單易行、融合效率高且融合子成活率高等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備條件要求高且費(fèi)用較貴[30]。最為常用的物理融合法是電融合法和激光誘導(dǎo)融合法，激光誘導(dǎo)融合法因?yàn)榧夹g(shù)難度比較大，目前還在研究。

電融合法基本原理是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下，原生質(zhì)體細(xì)胞緊密接觸，通過(guò)瞬時(shí)電壓擊穿細(xì)胞膜出現(xiàn)可逆性孔洞，短時(shí)間內(nèi)即可恢復(fù)，從而引起原生質(zhì)體膜的融合，使原生質(zhì)體在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生融合[36-38]。任軒等[39]以杏鮑菇和平菇為親本菌株，兩菌株按1∶1混合，運(yùn)用電場(chǎng)誘導(dǎo)使其電融合，1 MHz、250 V/cm的成串脈沖電壓，5.5 kV/cm 的融合脈沖電壓時(shí)，杏鮑菇和平菇原生質(zhì)體成對(duì)率達(dá)到70%，融合率為3.2×10-3。燕曉翠[40]利用電場(chǎng)誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳和釀酒酵母的原生質(zhì)體融合，當(dāng)交變電壓和交變頻率分別為30 V、1 100 kHz，脈沖場(chǎng)強(qiáng)、脈沖個(gè)數(shù)、脈沖間隔分別為6 kV/cm、4 個(gè)、10 μS 時(shí)，融合率為4.396×10-5，篩選出的3 株疑似融合株皆為親本原生質(zhì)體融合的產(chǎn)物。

3 融合子的鑒定

如何鑒定原生質(zhì)體融合子關(guān)系到整個(gè)融合是否成功，因?yàn)槿诤象w中可能會(huì)存在親本、異核體、部分結(jié)合子、雜合二倍體、雜合系和融合子等，它們都會(huì)再生形成菌落，互相影響，從而抑制具有優(yōu)良性狀的融合子生長(zhǎng)，所以如何鑒定并及時(shí)分離融合子，是原生質(zhì)體融合成功的關(guān)鍵，尤為重要。鑒定融合子的常用方法有生物法和分子標(biāo)記法。

3.1 生物法

3.1.1 菌落形態(tài)法 菌落形態(tài)法是對(duì)融合菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，根據(jù)菌絲及菌落形態(tài)特征、生長(zhǎng)速度、孢子形態(tài)等比對(duì)融合子再生菌落與親本菌落的差異性，并進(jìn)行下一步篩選[26]。

3.1.2 細(xì)胞學(xué)形態(tài)法 原生質(zhì)體融合子在萌發(fā)初期菌絲體核分布不同于親本，融合子再生菌絲細(xì)胞核分布非?；靵y，可以根據(jù)這一特點(diǎn)鑒定融合子。具體方法為通過(guò)凹玻片微培養(yǎng)，然后用吉姆薩（Giemas）結(jié)合蘇木精進(jìn)行染色，最后鏡檢，觀察比對(duì)菌絲頂端生長(zhǎng)情況及分枝、核相和鎖狀聯(lián)合[30]。

3.1.3 拮抗實(shí)驗(yàn)法 由于拮抗實(shí)驗(yàn)法具有直觀、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，一般應(yīng)用較多，拮抗實(shí)驗(yàn)具體方法是將兩個(gè)親本菌株與融合子菌株有間隔地接到同一培養(yǎng)皿上，融合子重組了雙親的遺傳物質(zhì)，則有了新的遺傳特性，當(dāng)菌絲長(zhǎng)到交匯處時(shí)，如果與雙親都不親和就會(huì)出現(xiàn)拮抗線，且越明顯說(shuō)明它們遺傳差異越大，若菌絲體無(wú)分界線則為同一菌株[41]。

3.1.4 出菇試驗(yàn)法 通過(guò)讓融合子和親本出菇，可以直接觀察融合子的形態(tài)特征，由于融合子為雜種異核體，在適宜的條件下，有可能會(huì)形成子實(shí)體，其性狀會(huì)介于兩親本，因此，可以從子實(shí)體的形態(tài)、色澤等特征上進(jìn)行篩選[28]。

若要鑒定融合子融合是否成功大多采用菌落形態(tài)、細(xì)胞學(xué)、拮抗實(shí)驗(yàn)、出菇試驗(yàn)等方法相互結(jié)合、相互印證?？盗种サ萚42]探究金針菇與平菇遠(yuǎn)緣親本原生質(zhì)體融合，通過(guò)菌絲形態(tài)、細(xì)胞學(xué)觀察，拮抗實(shí)驗(yàn)、出菇試驗(yàn)驗(yàn)證融合再生菌株，從18 個(gè)再生菌株中選擇出1 株耐34 ℃高溫金針菇菌株，且融合菌株為子實(shí)體粗壯、原基形成較多、菇形好的金針菇新品種，命名為F1P8。孫艷穎等[43]采用原生質(zhì)體制備與再生篩選單核菌絲，進(jìn)行香菇L808 和A288 雜交育種研究，初篩獲得15 個(gè)雜交菌株。利用酯酶同工酶技術(shù)復(fù)篩，獲得香菇原生質(zhì)體雜交子10 個(gè)，然后進(jìn)行出菇試驗(yàn)，結(jié)果表明，7 個(gè)雜交子正常出菇，2S-21、2S-28出菇早、產(chǎn)量高；2S-24 出菇雖晚但菇蓋圓正，菇柄短粗、單生，商品性狀好。2S-21、2S-24 和2S-28 的生物學(xué)效率達(dá)到82.70%、61.64%和88.82%，明顯高于親本香菇L808 和A288 的生物學(xué)效率（46.23%和50.78%）。孫艷穎[44]又以滑子菇早豐112 和滑子菇C3 為親本進(jìn)行原生質(zhì)體的融合，得到的滑子菇原生質(zhì)體融合子再生后，經(jīng)過(guò)初步篩選有18 個(gè)菌株和雙親具有拮抗現(xiàn)象，說(shuō)明融合子與滑子菇親本在遺傳性狀上具有差異。根據(jù)酯酶同工酶復(fù)篩結(jié)果，獲得14 個(gè)融合子，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，有10 個(gè)融合子成功出菇，其中有3 個(gè)出菇性狀較好的菌株。

3.2 分子標(biāo)記法

分子標(biāo)記，又稱(chēng)DNA 標(biāo)記，是生物遺傳標(biāo)記的一種，指可遺傳并可以檢測(cè)以及能用來(lái)作為指紋區(qū)分鑒定個(gè)體特征的DNA 片段，能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征DNA 片段，直接反映基因組中DNA 間的差異[27]。食用菌原生質(zhì)體融合子的分子鑒定主要采用ISSR 標(biāo)記技術(shù)和RAPD 標(biāo)記技術(shù)。

3.2.1 ISSR 標(biāo)記技術(shù) 簡(jiǎn)單序列間重復(fù)序列（ISSR）是一種在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速、高效、耗資少、模板DNA 用量少、遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是鑒定和確定品種遺傳多樣性的理想方法[45]。孫曉瑞[5]采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)秀珍菇和榆黃蘑原生質(zhì)體融合情況進(jìn)行遺傳驗(yàn)證，證實(shí)融合子含有雙親遺傳物質(zhì)。鄭錦榮[46]探究金針菇和巨大口蘑原生質(zhì)體融合育種，對(duì)獲得的3 株融合菌株R13、R14、R15 利用ISSR 技術(shù)進(jìn)行遺傳系數(shù)和聚類(lèi)分析來(lái)鑒定融合株，結(jié)果表明，3 株融合菌株與巨大口蘑遺傳相似系數(shù)均為0.49，與金針菇的遺傳相似系數(shù)均為0.45。可以初步判斷R13、R14、R15 均為新菌株，與雙親親緣關(guān)系不明顯。蔡佺佑[47]將秀珍菇與巨大口蘑的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征觀察比較，篩選獲得2 株融合菌株：R7-1 和R7-2，且菌絲生長(zhǎng)速度快，與親本形成較為明顯的拮抗線，采用ISSR 技術(shù)對(duì)R7-1 和R7-2 兩株融合菌株進(jìn)行鑒定，初步說(shuō)明R7-1 和R7-2 均為新菌株。

3.2.2 RAPD 標(biāo)記技術(shù) RAPD 即隨機(jī)多態(tài)性DNA技術(shù)，是由美國(guó)科學(xué)家WILLIAMS 等[48]和WEISH 等[49]于1990年和1991年分別研究提出的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，又稱(chēng)為任意引物PCR。隨機(jī)多態(tài)性DNA 技術(shù)，是以PCR 為基礎(chǔ)，以一個(gè)隨機(jī)寡核苷酸序列為引物（約10 個(gè)堿基），以試驗(yàn)材料基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，找出擴(kuò)增段的多態(tài)性。該技術(shù)應(yīng)用廣泛，無(wú)需專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)RAPD 擴(kuò)增反應(yīng)引物，引物具有通用性，成本低，DNA 樣品用量少且純度要求不高，該技術(shù)簡(jiǎn)單易行、省時(shí)省力。楊珊[6]以猴頭菌株0605 和猴頭菌刺長(zhǎng)為試驗(yàn)材料進(jìn)行原生質(zhì)體融合，第一輪挑選出67 株生長(zhǎng)速度較快的融合再生菌株，第二輪采用SSCP 和RAPD 法進(jìn)行鑒定，篩選出14 株融合菌株，分析14 株融合菌株生物學(xué)性狀，可知R17 的菌絲體多糖含量比親本0605 提高了7.43%；R51 和R53 的菌絲體生長(zhǎng)速度最快，比親本菌株0605 提高了24.48%。王珂[50]利用雙滅活融合技術(shù)，將梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌原生質(zhì)體融合，采用RAPD 標(biāo)記對(duì)親本及融合子進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，雙親本與融合子分為3 大類(lèi)群：第一類(lèi)群包括親本梯棱羊肚菌（P1），第二類(lèi)群包括所有融合子，第三類(lèi)群包括親本六妹羊肚菌（P2），從聚類(lèi)分析可得出結(jié)論為真正的融合子。

4 存在的問(wèn)題與展望

4.1 存在的問(wèn)題

原生質(zhì)體的制備及再生是原生質(zhì)體融合技術(shù)的前提與基礎(chǔ)，不同種類(lèi)的食用菌制備條件各不相同，因此，不同種類(lèi)的食用菌必須嚴(yán)格篩選、制備和再生的條件。食用菌原生質(zhì)體融合可通過(guò)生物、化學(xué)、物理等方法，但生物融合法存在一定的不安全性、融合率低、操作較復(fù)雜，未在食用菌原生質(zhì)體融合領(lǐng)域應(yīng)用[29-30]；化學(xué)融合法中聚乙二醇作為促融劑不好把握原生質(zhì)體聚集成團(tuán)的程度，還會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生一定毒性，從而影響原生質(zhì)體的再生率和融合率[32]；物理融合法具有可控制融合條件、無(wú)毒害、操作簡(jiǎn)單易行、融合效率高且融合子成活率高等優(yōu)點(diǎn)[27]，應(yīng)大力推廣安全、無(wú)毒、易操作的物理融合法。 目前雖然有多達(dá)上百種食用菌原生質(zhì)體制備與再生方法的報(bào)道，但能融合形成穩(wěn)定融合子的種類(lèi)并不多，能投入實(shí)際生產(chǎn)的少之又少。

4.2 展望

原生質(zhì)體融合技術(shù)為食用菌育種提供了有效的方法與手段，以原生質(zhì)體的制備及再生為前提，通過(guò)生物、化學(xué)、物理等方法進(jìn)行原生質(zhì)體融合，通過(guò)生物法、分子標(biāo)記法相結(jié)合對(duì)融合子進(jìn)行鑒定，可實(shí)現(xiàn)品種改良、新品種選育特別是野生種馴化等。

雖然食用菌原生質(zhì)體育種研究較晚，但發(fā)展迅速，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)使食用菌在跨種、跨屬、跨科甚至更高分類(lèi)層次上的雜交成為可能，同時(shí)原生質(zhì)體融合技術(shù)具有遺傳信息傳遞量大、技術(shù)難度小、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、成本低廉、未知雙親遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。