基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中藥復(fù)方治療新型冠狀病毒肺炎研究進(jìn)展

趙 佳，張 菁

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 杭州 310016)

2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織宣布新冠肺炎疫情為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。由于病毒在全球范圍內(nèi)傳播，COVID-19引起全球醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。截至2020年9月10日，國內(nèi)新冠肺炎累積確診人數(shù)達(dá)到90 596例，累積死亡4 740例。全球累計確診27 939 325例，累計死亡903 320例[1]。目前，COVID-19由可用的抗病毒藥物治療，以改善癥狀為主，嚴(yán)重時對感染患者還可使用包括氧氣和機(jī)械通氣支持治療[2]。然而，鑒于迄今為止的高死亡率，必須研制出有效藥物和疫苗來對抗COVID-19感染。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程，從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)[3]。與傳統(tǒng)藥理學(xué)方法相比，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，因此特別適合揭示具有多種成分、多靶點(diǎn)的中藥作用機(jī)制。鑒于利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段揭示新型冠狀肺炎成為研究熱點(diǎn)，本文旨在對基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中藥復(fù)方治療新型冠狀肺炎的研究進(jìn)行綜述。

1 經(jīng)典方劑研究

1.1 清肺排毒湯

清肺排毒湯來源于中醫(yī)經(jīng)典方劑組合，出自漢代張仲景所著《傷寒雜病論》，包括麻杏石甘湯、射干麻黃湯、小柴胡湯、五苓散等，性味平和[4]。該方為疾病治療方劑，不建議作為預(yù)防方使用。許冬玉等[5]分別通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行活性成分篩選，將得到的活性成分及其作用靶點(diǎn)在Uniprot 數(shù)據(jù)庫和 String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，并用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，結(jié)果表明，依據(jù)自由度值排序，清肺排毒湯活性最高的成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素和異鼠李堿，主要作用靶點(diǎn)為MAPK1、 MAPK3、 MAPK8、 MAPK14、 IL-6、 RELA、 STAT1。最后再通過靶點(diǎn)基因本體論(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 通路富集分析發(fā)現(xiàn)清肺排毒湯主要作用于TNF 信號通路、 IL-17 信號通路、 NF-κB 信號通路及Th17 細(xì)胞分化等通路，表明清肺排毒湯主要通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用，來達(dá)到減輕肺功能損傷、保護(hù)神經(jīng)功能的作用。

1.2 柴葛暢源湯

柴葛暢源湯來源于清代名醫(yī)王九峰治時邪經(jīng)驗(yàn)，是貴州省中醫(yī)藥管理局發(fā)布的用于預(yù)防新型冠狀病毒肺炎的湯劑。柴葛暢源湯由14味中藥組成，分別為柴胡、葛根、穿心蓮、防風(fēng)、前胡、紫蘇梗、黨參、青皮、大棗、生姜、西洋參、黃芩、腫節(jié)風(fēng)、廣藿香。楊亮等[6]通過ETCM和TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索柴葛暢源湯的主要活性成分及其對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，然后通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫可以得到新型冠狀肺炎的靶點(diǎn)，通過Venny圖進(jìn)行合并預(yù)測得到柴葛暢源湯預(yù)防新型冠狀病毒肺炎的63個靶點(diǎn)。對這些靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得到活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)柴葛暢源湯主要通過抗病毒，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、生長、遷移，氧穩(wěn)態(tài)和調(diào)解免疫，來發(fā)揮預(yù)防新型冠狀病毒的作用。

1.3 葛根芩連湯

葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連和甘草組成，同樣源自漢代張仲景所著《傷寒雜病論》。夏婷等[7]借助TCMSP篩選復(fù)方中活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)。與其他研究不同的是研究者在Drug Bank數(shù)據(jù)庫中搜索的不是以新型冠狀肺炎為關(guān)鍵詞，而是以新型冠狀病毒肺炎的癥狀為關(guān)鍵詞，即“干咳、發(fā)熱、呼吸困難”的靶點(diǎn)。繼續(xù)利用Uniprot數(shù)據(jù)庫后續(xù)分析，Cytoscape 軟件構(gòu)建可視化化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果顯示葛根芩連湯共有133個活性成分，再通過DAVID數(shù)據(jù)庫分別對葛根芩連湯改善 COVID-19 引發(fā)的干咳、發(fā)熱、呼吸困難進(jìn)行GO、KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯可能通過調(diào)節(jié) SCN5A、ACHE、ADRA1B、CHRM1、SLC6A4 等靶點(diǎn)作用于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、鈣信號通路、膽堿能突觸通路；而葛根、黃芩均是解肌退熱的常用藥物，可能通過調(diào)節(jié) ADRA1B、ADRB2、PTGS1、PTGS2、PPARG 等靶點(diǎn)作用于心肌細(xì)胞腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，達(dá)到退熱的效果。而通過ADRB2、ADRA1B、ADRA1A、ADRA1D 等靶點(diǎn)作用于心肌細(xì)胞腎上腺素信號通路、cGMP-PKG 信號通路、鈣信號通路發(fā)揮改善呼吸困難的作用。最后通過分子對接手段驗(yàn)證了活性成分主要通過氫鍵、π-π 共軛及范德華力相互作用與β2腎上素腺能受體結(jié)合，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、膽堿能突觸通路等改善 COVID-19 引發(fā)的干咳、發(fā)熱和呼吸困難等癥狀。

1.4 黃連解毒湯

黃連解毒湯源自唐代王燾所著的《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味藥組成，具有瀉火解毒的功效[8]。黃浪浪等[9]依托TCMSP平臺篩選黃連解毒湯的有效活性成分，其中作用最強(qiáng)的化合物為β-谷甾醇、漢黃芩素、槲皮素、黃芩素、金合歡素和木蝴蝶素。后在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得新型冠狀肺炎的靶點(diǎn)，進(jìn)而推測出黃連解毒湯治療新型冠狀肺炎的16個靶點(diǎn)，按自由度值大小，最高靶點(diǎn)依次為MAPK1、MAPK14、CCL2、IL-1B、IL6、PPARG、PTGS2、NOS2、HMOX1、IFNG。隨后進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)GO生物過程主要涉及炎癥應(yīng)答、氧化還原過程、蛋白表達(dá)等，主要通過 IL-17、HIF-1、TNF 等信號通路發(fā)揮作用。

1.5 麻杏苡甘湯

麻杏苡甘湯出自張仲景的《金匱要略》，由麻黃、杏仁、薏苡仁、甘草4味藥物組成，被推薦用于發(fā)熱、咳嗽伴乏力等癥狀的 COVID-19 患者[10]。于丹等[11]從TCMSP平臺篩選出麻杏苡甘湯的活性成分，即槲皮素、翠雀素、木犀草素、谷甾醇。再通過TTD、Genecards數(shù)據(jù)庫獲取新型冠狀肺炎的靶標(biāo)。后通過韋恩圖獲得麻杏苡甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的靶點(diǎn)。最后在String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。最終發(fā)現(xiàn)麻杏苡甘湯可通過 HIF-1 signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、Fox O signaling pathway 等通路作用于新型冠狀病毒肺炎。

1.6 新加香薷飲

新加香薷飲源自吳鞠通所著的 《溫病條辨》，由香薷、 金銀花、連翹、 厚樸、 扁豆花5味中藥組成[12]。楊秀娟等[13]借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，獲得新加香薷飲的49個活性成分。通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)有33條通路涉及肺病、 病毒感染、炎癥-免疫等過程，其中MAPK1、 E2F1、 RELA、 AKT1、CASP9、 NOS2在肺病通路中最為富集；RELA、 NFKBIA、 TP53、IKBKB、 JUN、 IL-6、 CHUK、 AKT1在病毒相關(guān)通路中最為富集；RELA、 MAPK14、MAPK1、NFKBIA、IKBKB、CHUK、TNF、IL-1β、CXCL8、 AKT1、 MAPK8、 JUN、 IL-6、 FOS、 SRC在炎癥免疫相關(guān)通路中最為重要。后將所有靶點(diǎn)進(jìn)行組織富集分析發(fā)現(xiàn)新加香薷飲活性成分的靶點(diǎn)主要在肺部、 肝臟、 血液相關(guān)部位等多個組織中表達(dá)。而用分子對接手段發(fā)現(xiàn)麝香草酚、 香荊芥酚、 綠原酸、 咖啡酸、厚樸酚、 和厚樸酚和金圣草黃素均與 SARS-CoV-2、3CL水解酶和ACE2表現(xiàn)出較好的親和力，進(jìn)一步驗(yàn)證了新加香薷飲的抗病毒作用。

1.7 不換金正氣散合麻黃羌活湯和化濕敗毒方

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中，不換金正氣散合麻黃羌活湯為治療普通型的寒濕阻肺證使用的湯劑，化濕敗毒方為重型的疫毒閉肺證使用的湯劑。不換金正氣散合麻黃羌活湯含有9味中藥，分別為蒼術(shù)、陳皮、厚樸、藿香、草果、麻黃、 羌活、生姜、檳榔?；瘽駭《痉接?4味中藥組成，即麻黃、杏仁、生石膏、甘草、藿香、厚樸 、 蒼術(shù)、 草果、法半夏、茯苓、大黃、黃芪、葶藶子、赤芍。郝德國等[14]通過TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選，得到不換金正氣散合麻黃羌活湯 92 種活性成分，化濕敗毒方 247 種活性成分。再由Stitch 數(shù)據(jù)庫和 SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫查找兩種湯劑所含活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，在Cytoscape中以可視化網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)，同時和Gene Cards數(shù)據(jù)庫中查找的疾病靶點(diǎn)取交集，分別得到60個交集靶點(diǎn)和81個交集靶點(diǎn)，也就是兩種湯劑作用于新型冠狀肺炎的靶點(diǎn)。通過構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)得到核心靶點(diǎn)如下：MAPK1、 MAPK3、 TP53、IL6、EGFR、HRAS、FOS、MAPK14、IL2、MAPK8、CSF2、PIK3R1、CASP3、CREBBP(不換金正氣散合麻黃羌活湯)；RELA、 MAPK1、 HRAS、TNF、PIK3CA、IL2、NFKB1、PIK3R1、IL6、TP53、MAPK14、EGFR、FOS、CCL2、CASP3(化濕敗毒方)。對核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)主要富集通路為TNF 信號通路和MAPK 信號通路，主要富集的生物學(xué)過程是抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用。

2 中成藥研究

2.1 連花清瘟

連花清瘟方由《溫病條辨》中的銀翹散和《傷寒論》中的麻杏石甘湯化裁而來，由連翹、金銀花、麻黃、苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、 薄荷腦、 甘草組成[15]。凌曉穎等[16]研究表明，連花清瘟能明顯改善COVID-19 確診的普通型患者發(fā)熱、咳嗽、咳痰、氣促等臨床癥狀，緩解病情以及縮短病程。利用TCMSP以及BATMAN數(shù)據(jù)庫的設(shè)定，篩選出連花清瘟中160個活性成分。然后結(jié)合Swiss數(shù)據(jù)庫中藥物靶點(diǎn)和Gene Cards數(shù)據(jù)庫中疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，取交集得到67個靶點(diǎn)，即為連花清瘟抗COVID-19的靶點(diǎn)。通過Cytoscape構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)槲皮素 、山柰酚 、木犀草素、β-谷甾醇、靛藍(lán)、漢黃芩素、色胺酮、芐叉丙酮、1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮、豆甾醇、柚皮素、甘草次酸為連花清瘟方抗冠狀病毒的主要活性成分。其中靛藍(lán)、色胺酮，大黃中芐叉丙酮，1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮，蛇根平定又可共同作用于靶點(diǎn) ACE2。通過PPI蛋白互作分析，推測除ACE2外，連花清瘟方的有效成分還可能通PTGS2、 IL6、CASP3、MAPK1、EGFR 等靶點(diǎn)發(fā)揮抗冠狀病毒的作用。KEGG分析結(jié)果顯示連花清瘟主要與 TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路、RIG-I 樣受體信號通路、TGF-beta 信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等有著密切聯(lián)系。主要參與的生物學(xué)過程為T 細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、I 型干擾素信號通路等相關(guān)。

2.2 三味龍膽花片

三味龍膽花片是由白花龍膽、 甘草及蜂蜜干膏組成，用于治療肺熱氣喘和咽喉炎[17]。趙芡等[18]在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索三味龍膽花片中的活性成分共有101個 ，其中高良姜素、黃芩素、甘草香豆酮、 桑色素、槲皮素、山柰酚、異鼠李為三味龍膽花片的核心活性成分。再利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，得到化合物對應(yīng)的656個靶點(diǎn)信息。通過蛋白互作分析得到核心靶點(diǎn)為MAPK3、 EGFR、 CASP3、 STAT3、 ESR1。且對接結(jié)果顯示三味龍膽花片中核心活性成分如甘草香豆酮、 槲皮素、 山柰酚與靶點(diǎn) ACE2、 RdRp、3CLpro 的結(jié)合能與對照藥物接近，部分化合物與靶點(diǎn)的親和力更強(qiáng)。后續(xù)富集分析結(jié)果顯示，相關(guān)通路多集中在抗炎、調(diào)節(jié)免疫等方面。其中富集度高且與抗 COVID-19 最為相關(guān)的信號通路主要涉及鈣離子信號通路、 花生四烯酸代謝通路、 MAPK 信號通路、 TRP 通道、 腎素血管緊張素系統(tǒng)等。

2.3 血必凈注射液

血必凈是由阿魏酸、苯甲酰芍藥苷、 丹參素、 丹酚酸 A、 芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷、 洋川芎內(nèi)酯 I、 原兒茶醛、 原兒茶酸等22味中藥組成的中成藥。戴雅吉等[19]在TCMSP和SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫中獲取主要成分的靶點(diǎn)，再通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到COVID-19相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，取交集得到54個靶點(diǎn)即為血必凈注射液治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)。再將54個靶點(diǎn)導(dǎo)入 BioGPS 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)血必凈的靶點(diǎn)主要位于肺、心臟、肝臟、全血。而將靶點(diǎn)輸入String，得到的核心靶點(diǎn)為IL6、TNF、MAPK1、GAPDH、TP53、CASP3、ALB、EGFR、MAPK8、IL2、CASP8、FGF2、ITGB1、SERPINE1。且分子對接實(shí)驗(yàn)表明血必凈22個主要成分與 SARS-CoV-2、3CL 均能穩(wěn)定結(jié)合。富集分析結(jié)果表明，血必凈注射液主要參與催化活性、抗氧化活性、細(xì)胞增殖等生物功能，以及脂多糖應(yīng)答、刺激反應(yīng)、代謝過程、免疫系統(tǒng)進(jìn)程等生物過程。關(guān)鍵靶點(diǎn)富集通路主要有 T 細(xì)胞受體、TNF、HIF-1、PI3K-Akt、MAPK、FoxO 等調(diào)控免疫、抗炎癥通路。

3 結(jié)語

COVID-19可以進(jìn)入到表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2(ACE2)的細(xì)胞中，但不能進(jìn)入到不表達(dá) ACE2 的細(xì)胞中，因此，ACE2 是 COVID-19感染細(xì)胞必不可少的蛋白[20]，因此，很多研究都利用分子對接手段探索了中藥與ACE2的結(jié)合情況以證明中藥潛在的抗病毒作用。另外，細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致新冠肺炎部分重癥患者在疾病進(jìn)展過程中會出現(xiàn)多器官功能衰竭、 急性呼吸窘迫等嚴(yán)重并發(fā)癥甚至死亡[21]。因此，在對新型冠狀病毒感染患者的治療中，除依據(jù)國家衛(wèi)健委正式公布認(rèn)可的抗病毒治療方案外，還應(yīng)密切關(guān)注細(xì)胞因子風(fēng)暴帶來的巨大沖擊，這對于重癥患者的治療、降低病死率具有重要意義。以上眾多研究結(jié)果均提示，中草藥對病毒性肺炎和細(xì)胞因子風(fēng)暴具有多靶點(diǎn)抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用，因此，中醫(yī)藥在COVID-19 的治療中發(fā)揮了重要作用。但值得注意的是，完全依靠數(shù)據(jù)挖掘的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法存在一定的局限性，仍需要后續(xù)細(xì)胞以及動物實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。