養(yǎng)殖暗紋東方鲀中7 種醇提鮮味肽的鑒定及其呈鮮特性

寧夢(mèng)華，王文利，陳高樂(lè)，劉 源

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海 200240）

鮮味肽是一類(lèi)分子質(zhì)量小于3 000 Da的寡肽類(lèi)，具有鮮味醇厚圓潤(rùn)、后味綿長(zhǎng)的呈味特點(diǎn)[1]。鮮味肽主要來(lái)自于蛋白質(zhì)合成和分解的中間產(chǎn)物，屬于營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)[2]。近年來(lái)從食品中發(fā)掘天然的鮮味肽成為風(fēng)味研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3]，如從雞肉（湯）[4]、牛肉（湯）[5]、河鲀[6]、文蛤[7]、鱈魚(yú)[8]、火腿[9]、花生蛋白[10]、腐乳[11]、干酪[12]、豆豉[13]等物質(zhì)中發(fā)掘了系列鮮味肽。截止2020年8月份，從不同食物中發(fā)掘鑒定的鮮味肽已有179 條。養(yǎng)殖暗紋東方鲀營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，前期課題組發(fā)現(xiàn)鮮味肽對(duì)河鲀鮮美圓滑、醇香濃郁的味感具有決定性貢獻(xiàn)[14-18]。目前鮮味肽的發(fā)掘大多是水提取法，關(guān)于溶劑提取對(duì)鮮味肽的特性影響尚不明確。

近年來(lái)，鮮味分子的味覺(jué)機(jī)制以及鮮味受體對(duì)鮮味肽的識(shí)別機(jī)制備受關(guān)注。同源建模及分子對(duì)接應(yīng)用于鮮味配體及受體之間結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算，可解釋鮮味分子與受體之間的作用機(jī)制，如以代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1）的晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建了T1R1/T1R3模型，考察其與谷氨酸[19]以及鮮味肽[7-8,13]的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)和自由能。此外，谷氨酸與5’-鳥(niǎo)苷酸二鈉（disodium 5’-guanylate，GMP）[20]和鮮味肽[21]的協(xié)同作用機(jī)制也基于分子動(dòng)力學(xué)被闡釋。Liu Hai等[22]以同源性更高的魚(yú)味覺(jué)受體T1R1/T1R3建立了人的T1R1/T1R3受體結(jié)構(gòu)模型，較為系統(tǒng)考察谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）、琥珀酸二鈉、GMP、肌苷酸二鈉和牛肉辛肽（beefy meaty peptide，BMP）5 類(lèi)鮮味分子，探究不同鮮味配體結(jié)合對(duì)受體T1R1/T1R3結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)受體口袋的調(diào)整作用，進(jìn)而從原子水平上部分揭示了其呈鮮機(jī)理。整體來(lái)看，分子模擬可作為有效可行的方法用于鮮味肽與T1R1/T1R3受體的作用研究。

本研究以乙醇溶液提取暗紋東方鲀肌肉中的鮮味肽，并采用分子模擬研究鮮味肽的呈鮮特性，在發(fā)掘新型鮮味肽的同時(shí)，擬進(jìn)一步解釋鮮味肽的構(gòu)效關(guān)系，為后期進(jìn)一步探究肽的呈鮮規(guī)律提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30 尾2 齡養(yǎng)殖暗紋東方鲀購(gòu)買(mǎi)于江蘇中洋集團(tuán)股份有限公司，參考SC/T 3033—2016《養(yǎng)殖暗紋東方鮮、凍品加工操作規(guī)范》，專(zhuān)業(yè)廚師對(duì)暗紋東方鲀進(jìn)行剖殺、放血、去頭、去皮、去內(nèi)臟。經(jīng)處理的河鲀魚(yú)被冰鮮運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，從每條魚(yú)取下兩片完整背部肌肉，取肉分裝于鋁箔袋，抽真空后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、碳酸氫銨（均為色譜純）美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；甲酸（色譜純） 上海安譜科技股份有限公司；其他所需試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T25高速分散機(jī) 德國(guó)IKA公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Alpha1-2 LDplus真空凍干機(jī)德國(guó)Chirist公司；NW10VF超純水系統(tǒng) 中國(guó)香港力康發(fā)展有限公司；BT-100L實(shí)驗(yàn)用膜分離裝置上海摩速科學(xué)器材有限公司；RH-digital磁力攪拌器德國(guó)IKA公司；?KTA pure蛋白純化系統(tǒng)、SuperdexTM30 Increase 10/300 GL凝膠色譜柱 美國(guó)通用電氣醫(yī)療公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司；C-Tongue電子舌系統(tǒng) 上海保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Easy nLC1200-Q Eaxtive plus納升液相四極桿軌道阱質(zhì)譜儀、離心濃縮儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 60 %乙醇溶液提取暗紋東方鲀肌肉中鮮味肽

基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考Zhang Meixiu等[16]的方法略作調(diào)整，用60%乙醇溶液提取河鲀肌肉中的鮮味肽。-80 ℃的暗紋東方鲀肌肉置于4 ℃冰箱過(guò)夜解凍，去除肌肉上的肌膜，準(zhǔn)確稱(chēng)取200 g，魚(yú)肉絞碎后按照料液比為1∶4（g/mL）添加60%乙醇溶液進(jìn)行勻漿（10 000 r/min，10 s×3），將勻漿液置于4 ℃條件下攪拌提取3 h。隨后將勻漿液4 ℃、9 500×g離心20 min，取上清液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的乙醇，此提取過(guò)程進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，合并3 次除醇上清液，即得到暗紋東方鲀肌肉乙醇溶液提取的鮮味肽組分。

1.3.2 鮮味肽組分的超濾分級(jí)

將1.3.1節(jié)中60%乙醇溶液提取物用0.22 μm濾膜過(guò)濾，隨后用截留分子質(zhì)量分別為3 000 Da超濾膜和300 Da納濾膜進(jìn)行膜過(guò)濾分級(jí)，最終得到3 個(gè)不同分子質(zhì)量范圍的組分，即U1（＜300 Da），U2（300～3 000 Da）和U3（＞3 000 Da），將此3 個(gè)分級(jí)組分進(jìn)行真空冷凍干燥，收集各自?xún)龈煞蹆?chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 鮮味肽組分的凝膠色譜分離

取1.3.2節(jié)中的U2凍干粉用超純水配制成5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾后，隨后在?KTA pure蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行凝膠色譜分離純化。具體色譜條件如下：色譜柱為SuperdexTM30 Increase 10/300 GL預(yù)裝柱，上樣體積為500 μL，流動(dòng)相為超純水，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。使用蛋白純化儀餾分自動(dòng)收集器收集不同峰組分，分別凍干后將其保存于-80 ℃冰箱中，留待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.4 納升液相色譜-質(zhì)譜鑒定鮮味肽的結(jié)構(gòu)

鮮味肽的結(jié)構(gòu)鑒定參考Bennike等[23]的方法略作調(diào)整。取1.3.3節(jié)凝膠色譜分離組分F2，加入100 μL溶液上樣緩沖液（99.9% H2O、0.1%甲酸）溶解，取50 μL溶解好的樣品用ZipTip脫鹽處理并干燥，利用10 μL上樣緩沖液溶解干燥的樣品，將溶解樣品加入樣品瓶中待測(cè)。

液相色譜條件：分析柱為C18反相分析柱（50 mm×50 cm整體柱）；流動(dòng)相A為99.9%水和0.1%甲酸混合液，流動(dòng)相B為80%乙腈和0.1%甲酸混合液。液相洗脫梯度為0～2 min，98%～95% A、2%～5% B；2～45 min，95%～78% A、5%～22% B；45～53 min，78%～65% A、22%～35% B；53～54 min，65%～0%A、35%～100% B；54～60 min，0% A、100% B；流動(dòng)相流速為500 nL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式，采用數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描模式，在分辨率為70 000（自動(dòng)增益控制3×106）的軌道阱中進(jìn)行全掃描采集（m/z350～1 800）。將分離出的前20 個(gè)肽信號(hào)（電荷態(tài)≥+1）母離子通過(guò)高能碰撞破碎，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能為28.0 eV。毛細(xì)管溫度為275 ℃，噴霧電壓為1 800 V，子離子在分辨率為17 500（自動(dòng)增益控制1×105）的軌道上測(cè)量。全掃描和串聯(lián)質(zhì)譜掃描的最大填充時(shí)間分別設(shè)置為50 ms和45 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30 s。利用Peaks studio10.0軟件搜索引擎及Protein Discoverer 2.4軟件對(duì)樣品中的多肽進(jìn)行序列分析。

質(zhì)譜鑒定得到鮮味肽的序列結(jié)構(gòu)后，委托上海吉爾生化有限公司對(duì)其進(jìn)行合成，采用固相合成法，并進(jìn)行脫鹽等處理得到純度大于98%的多肽。

1.3.5 感官評(píng)定

1.3.5.1 感官員培訓(xùn)

感官評(píng)定小組成員由3 名男性和7 名女性組成（20～30 歲），每位感官員均無(wú)味覺(jué)障礙史且通過(guò)篩選及培訓(xùn)。感官員培訓(xùn)參考Liu Ziyuan等[6]的實(shí)驗(yàn)，對(duì)感官員進(jìn)行5 種基本味道酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味以及濃厚感的培訓(xùn)，與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液如下：5 mmol/L檸檬酸溶液、10 mmol/L蔗糖溶液、1 mmol/L奎寧溶液、12 mmol/L氯化鈉溶液、10 mmol/L MSG溶液以及8 mmol/L谷胱甘肽溶液。感官實(shí)驗(yàn)在正常光照和室溫（（23±2）℃）進(jìn)行，樣品溶于超純水中，以5 mL的量盛放于標(biāo)有3 位隨機(jī)數(shù)字編號(hào)的30 mL感官小杯中隨機(jī)遞給感官員，為避免感官疲勞效應(yīng)和遺留效應(yīng)，每品嘗1 個(gè)樣品后用清水充分漱口且休息2 min。

1.3.5.2 河鲀提取物原始及純化組分的滋味輪廓

采用滋味描述及0～7 分鮮味評(píng)分法對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)定，在滋味描述中，要求感官員對(duì)樣品的滋味進(jìn)行評(píng)價(jià)并對(duì)5 種基本味覺(jué)強(qiáng)度進(jìn)行描述（0～7 分對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度描述詞為極弱、微弱、較弱、中等、較強(qiáng)、很強(qiáng)和極強(qiáng)）；在鮮味評(píng)分中，以超純水、0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL的MSG溶液為參照液，其鮮味分值分別定義為0、4 分和7 分，根據(jù)其分值對(duì)應(yīng)的鮮味強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。60%乙醇溶液提取凍干粉（60%-F）、超濾組分（U1、U2和U3）及凝膠色譜過(guò)濾組分（F1、F2和F3）分別溶于超純水中配制成5 mg/mL溶液，并轉(zhuǎn)移到30 mL的感官杯中，樣品溶液溫度保持在室溫，以隨機(jī)順序呈遞給感官員。感官員被要求啜飲樣品，在口腔中仔細(xì)品嘗后然后吐出。為避免感官疲勞和遺留效應(yīng)，每品嘗完一個(gè)樣品休息2 min并用50～60 mL超純水漱口，按上述方法對(duì)樣品進(jìn)行滋味描述及鮮味打分。

1.3.5.3 合成肽滋味描述及閾值測(cè)定

固相合成的多肽采用1.3.5.2節(jié)方法進(jìn)行人工感官滋味描述，并參考Zhang Ziyuan等[16]的方法稍作修改，以4 mmol/L的MSG為標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用電子舌味覺(jué)分析系統(tǒng)對(duì)7 條合成肽進(jìn)行智能感官評(píng)價(jià)。另外參考Toelstede等[24]的方法，對(duì)合成肽進(jìn)行了閾值的測(cè)定。合成肽重溶于超純水中至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，pH值調(diào)整為6.5，感官小組對(duì)其滋味特性進(jìn)行描述。隨后根據(jù)三角實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1 個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)組和2 個(gè)空白對(duì)照組，按照1∶1逐步稀釋?zhuān)鸺?jí)稀釋后的樣品依次呈遞給感官員品評(píng)。合成肽的呈味閾值為樣品組恰好與2 個(gè)空白組（超純水）區(qū)分的濃度，所有感官員的品評(píng)結(jié)果平均值記為最終結(jié)果。

1.3.6 鮮味肽與受體T1R1/T1R3的分子對(duì)接

使用Gauss View 5.0.9軟件構(gòu)建鮮味肽配體的結(jié)構(gòu)，在Biological Fragment模塊下按照鑒定的多肽氨基酸序列構(gòu)建其三維模型，通過(guò)Clean工具及UFF方法對(duì)其進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)計(jì)算，即得到鮮味肽的初始結(jié)構(gòu)。隨后基于DFT密度泛函法通過(guò)Gaussian 09軟件進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化。優(yōu)化后的鮮味肽配體結(jié)構(gòu)與鮮味受體T1R1/T1R3進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn)，鮮味受體結(jié)構(gòu)基于實(shí)驗(yàn)室前期Liu Hai等[22]構(gòu)建所得，分子對(duì)接在軟件AutoDock和AutoDock Vina軟件上完成。人源T1R1是鮮味識(shí)別關(guān)鍵受體[25]，參考Liu Hai等[22]的方法將對(duì)接盒子設(shè)在T1R1空腔區(qū)，大小為（30，30，30）。根據(jù)AutoDock Vina默認(rèn)的打分函數(shù)挑選出親和力最高（能量最?。┑膹?fù)合物結(jié)構(gòu)，所得配體T1R1/T1R3復(fù)合物結(jié)構(gòu)使用Pymol和VMD軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)可視化查看及結(jié)構(gòu)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀肌肉鮮味肽的分離純化

2.1.1 膜超濾法分離鮮味肽

3 個(gè)組分U1（＜300 Da）、U2（300～3 000 Da）和U3（＞3 000 Da）及粗組分（60%-F）感官評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1所示。U1（＜300 Da）主要由一些無(wú)機(jī)鹽和氨基酸類(lèi)小分子物質(zhì)組成[26]，鮮味表現(xiàn)不明顯。U2（300～3 000 Da）比其他兩個(gè)組分的鮮味顯著更強(qiáng)（P＜0.05），且與60%-F具有相似的滋味輪廓，說(shuō)明U2組分可代表河鲀提取物的滋味特征。前期研究表明鮮味肽的分子質(zhì)量通常都低于3 000 Da[11,27-28]。故選取U2進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，以期發(fā)掘其中的鮮味肽。

圖1 河鲀肌肉提取物超濾組分的滋味輪廓Fig.1 Taste profile of ultrafiltration fractions of pufferfish muscle extracts

2.1.2 凝膠層析法分離鮮味肽

根據(jù)洗脫曲線（圖2A）可知，凝膠色譜層析后主要得到5 個(gè)餾分，其中第1（F1）、第2（F2）和第3個(gè)餾分（F3）是U2的主要組成部分（93.3%），第4（F4）和第5個(gè)餾分（F5）占原始組分U2的比例較低（6.7%）?？紤]到感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)需要較多餾分樣本，因此采用感官評(píng)定對(duì)F1、F2和F3進(jìn)行分析（圖2B）。結(jié)果表明，3 個(gè)餾分的鮮味、咸味和酸味存在顯著差異，其中F2餾分的鮮味及酸味均強(qiáng)于F1和F3，同時(shí)F2的咸味也強(qiáng)于F3（P＜0.05）。鮮味和咸味具有協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)[29]，這可能是F2具有較強(qiáng)鮮味的一個(gè)主要原因。

圖2 300～3 000 Da超濾組分的凝膠色譜洗脫圖（A）和凝膠色譜純化組分滋味輪廓（B）Fig.2 Gel filtration chromatographic profile of ultrafiltration fractions with molecular mass of 300–3 000 Da (A), and taste profile of gel filtration chromatographic fractions of pufferfish extracts (B)

2.2 鮮味肽的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)納升液相色譜-質(zhì)譜鑒定餾分F2中的肽段分子質(zhì)量在1 000 Da左右，質(zhì)譜鑒定得到7 種主要肽段，包括1 條七肽、3 條九肽和3 條十一肽，具體肽段相關(guān)信息見(jiàn)表1及圖3。研究表明，肽的呈味特性與其氨基酸的組成密切相關(guān)，通常其感官特征與組成氨基酸的呈味特性呈正相關(guān)，鮮味肽的氨基酸組成往往表現(xiàn)為谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺之間相互結(jié)合或與蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸相互結(jié)合形成多元酸鈉鹽[30]。由表1可以看出，這幾條多肽均含有鮮味氨基酸天冬氨酸或谷氨酸，且甜味氨基酸蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸和丙氨酸占比較高，可能與多肽的鮮味特性呈正相關(guān)。

圖3 凝膠色譜分離組分F2中肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of peptides identified from gel filtration chromatographic fraction F2

表1 凝膠分離鮮味組分中鑒定的特征肽段Table 1 Signature peptide sequences identified in fractions separated by gel filtration chromatography

組成氨基酸殘基的疏水性影響肽的平均疏水性，Ney在1971年提出Q定則[31]至今仍被應(yīng)用于評(píng)價(jià)多肽的苦味強(qiáng)度，即以Q值表示肽的平均疏水性，計(jì)算式為：Q=∑Δf/n（其中，Δf表示肽段中氨基酸殘基側(cè)鏈從乙醇轉(zhuǎn)移至水的自由能變化，n為組成肽鏈的氨基酸殘基數(shù)）。通常多肽Q值大于1 400 cal/mol時(shí)表現(xiàn)明顯苦味，小于1 300 cal/mol時(shí)苦味不明顯，Q值介于兩者之間則不能判斷苦味的程度。經(jīng)計(jì)算這7 條肽的疏水性Q值范圍為682.2～1 120.7 cal/mol，表明苦味均不是這7 條多肽的主要呈味特征。綜合以上分析，這7 條多肽可能對(duì)養(yǎng)殖暗紋

東方鲀的鮮味具有積極影響，因此選取以上7 條肽段進(jìn)行化學(xué)合成，通過(guò)人工感官以驗(yàn)證其滋味特性。

2.3 鮮味肽的滋味特性

7 條合成肽段進(jìn)行感官滋味描述及鮮味閾值識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。從滋味描述可以發(fā)現(xiàn)，7 條合成肽均呈現(xiàn)鮮味特性，其中NK7兼具鮮味和甜味；KF9具有微弱的鮮味、甜味和苦味；KL9具有鮮味和弱苦味；AG9、AG11和ATG11主要表現(xiàn)為鮮味、甜味和濃厚感；RQ11具有鮮味和微弱的苦味和酸味；這7 條多肽的鮮味閾值范圍為0.38～1.04 mmol/L。7 條合成肽與標(biāo)準(zhǔn)品MSG的電子舌主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果如圖4所示，可以看出二維PC的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到96.7%，說(shuō)明該數(shù)據(jù)基本可代表原數(shù)據(jù)的全部信息。PC1在水平上貢獻(xiàn)最大（91.823%），說(shuō)明各樣品在水平距離越遠(yuǎn)，則差異越大。圖4中ATG11、AG11、NK7與MSG的水平距離最近，說(shuō)明這3 條多肽滋味特性更接近于MSG的鮮味，與人工感官測(cè)得這3 條肽鮮味閾值（分別為0.44、0.45 mmol/L和0.38 mmol/L）較低的結(jié)論一致。而鮮味肽KF9、KL9及RQ11的鮮味閾值較大，分別為1.04、0.92 mmol/L和0.81 mmol/L，相應(yīng)地它們與MSG距離也較遠(yuǎn)，AG9鮮味閾值（0.54 mmol/L）較低卻遠(yuǎn)離MSG，可能由于其感官甜味屬性協(xié)同增強(qiáng)其鮮味，導(dǎo)致人工感官的鮮味閾值偏低。從氨基酸組成來(lái)看，NK7呈現(xiàn)最低的鮮味閾值，可能與組成上有3 個(gè)鮮味氨基酸（兩個(gè)天冬氨酸和一個(gè)谷氨酸）有關(guān)，而多肽KF9鮮味閾值最大（1.04 mmol/L）且?guī)в锌辔?，可能與其末端疏水性氨基酸苯丙氨酸有關(guān)。Ishibashi等[32]研究結(jié)果也表明，苯丙氨酸和酪氨酸會(huì)增強(qiáng)多肽的苦味，尤其當(dāng)其位于多肽的C末端。Shinoda等[33]通過(guò)對(duì)酪蛋白中的苦味肽序列的研究，發(fā)現(xiàn)多肽N末端堿性氨基酸的存在會(huì)促進(jìn)苦味的感知，因此本研究中KF9和RQ11的苦味可能與N端賴(lài)氨酸和精氨酸有關(guān)。Liu Ziyuan等[6]對(duì)從紅鰭東方鲀中分離鑒定的7 條鮮味肽序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)末端含有精氨酸的肽序列呈現(xiàn)苦味且閾值較高，本實(shí)驗(yàn)RQ11研究結(jié)果與其相似。AG9、AG11和ATG11三條多肽具有相似的呈味特性，可能與其相似的氨基酸組成有關(guān)，且都能被感知到甜味，與其組成中甜味氨基酸（蘇氨酸、丙氨酸和甘氨酸）的含量高有關(guān)。

表2 合成肽水溶液滋味特性Table 2 Taste characteristics of synthetic peptides in aqueous solution

圖4 7 條合成肽與MSG的二維PCA圖Fig.4 Two-dimensional principal component analysis plot of seven synthetic peptides and MSG

2.4 鮮味肽與受體T1R1/T1R3的結(jié)合位點(diǎn)分析

基于Huang Yulin等[25]以受體T1R1為識(shí)別元件構(gòu)建了納米金傳感器考察不同鮮味物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，發(fā)現(xiàn)T1R1可作為鮮味識(shí)別的關(guān)鍵受體。因此，考察鮮味肽與受體T1R1的結(jié)合位點(diǎn)，7 條鮮味肽配體與鮮味受體T1R1/T1R3結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸情況如表3所示?？梢钥闯觯? 條鮮味肽共與受體上23 個(gè)氨基酸殘基通過(guò)氫鍵結(jié)合，其中有10 個(gè)氨基酸殘基為4 個(gè)以上鮮味肽的共同結(jié)合位點(diǎn)，包括S48、G49、N69、D147、T149、N150、R151、S217、S276和R277；對(duì)鮮味肽上與受體結(jié)合的氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鮮味肽序列中的親水性氨基酸殘基天冬氨酸、谷氨酸和賴(lài)氨酸出現(xiàn)頻次最高，分別為12、18 次和14 次，是被鮮味受體識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)。為更直觀地展現(xiàn)鮮味肽與T1R1/T1R3的結(jié)合情況，以與受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸較多的鮮味肽AG11為例，分析鮮味肽與受體的結(jié)合模式，AG11-T1R1/T1R3對(duì)接復(fù)合物如圖5所示。

表3 鮮味肽與鮮味受體T1R1/T1R3分子對(duì)活性位點(diǎn)中關(guān)鍵氨基酸殘基Table 3 Key amino acid residues around the active sites in umami peptides and T1R1/T1R3

圖5 鮮味肽AG11（主體為綠色的棒狀結(jié)構(gòu)）與受體T1R1/T1R3（紫色飄帶結(jié)構(gòu)）的對(duì)接復(fù)合物Fig.5 AG11 (rod-like structure, denoted in green)-T1R1/T1R3(streamer-like structure, denoted in purple) docking complex

從圖5可以看出，鮮味肽配體AG11通過(guò)氫鍵結(jié)合在受體T1R1的空腔內(nèi)，配體上負(fù)電基團(tuán)D6和E8通過(guò)氫鍵與受體上N150、A170、T149、S172等氨基酸殘基直接相互作用，配體的A1、L2、K10與受體上R151、G49、R277、N69、A302等氨基酸殘基相互結(jié)合，從而形成了一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。

Liu Hai等[22]以MSG和BMP為配體與T1R1/T1R3的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)T1R1受體上的N69、S276、R151、R277、A302、A170、D147、T149、S172、Y220、S385等氨基酸殘基是MSG和BMP與鮮味受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。本研究中鑒定的7 條鮮味肽也大多包含與BMP及MSG相似的結(jié)合位點(diǎn)（表3），除以上氨基酸殘基外，S48、S217、N150和G49等氨基酸殘基也存在多條鮮味肽與受體結(jié)合位點(diǎn)中，因此這些位點(diǎn)也可能對(duì)肽類(lèi)鮮味感知具有重要作用。這些與文獻(xiàn)[7-8,13]鮮味肽與受體T1R1/T1R3對(duì)接結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵位點(diǎn)（D196、E128、E429、N302、G304、H364等）不同，這可能由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用mGluR1的晶體結(jié)構(gòu)作為模板構(gòu)建了T1R1/T1R3模型和使用了Discovery Studio 4.0軟件中的CDOCKER模塊進(jìn)行的對(duì)接。

3 結(jié) 論

在本研究中，以60%乙醇溶液為提取溶劑，結(jié)合超濾納濾、凝膠色譜純化及納升液相色譜-質(zhì)譜從養(yǎng)殖暗紋東方鲀肌肉中分離鑒定出7 條鮮味肽NWDDMEK、KTGLSPDQF、KTDLNFENL、ASLDGEFKG、ALASLDGEFKG、ALTSLDGEFKG和RLGSSEVEQVQ，鮮味閾值范圍為0.38～1.04 mmol/L。鮮味肽上的氨基酸殘基天冬氨酸、谷氨酸及賴(lài)氨酸等與受體上的N69、S276、R151、R277、A302、T149和N150等氨基酸基團(tuán)對(duì)鮮味的呈現(xiàn)具有重要作用。本研究為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鮮味肽的呈鮮規(guī)律，闡明鮮味肽構(gòu)效關(guān)系提供一定的參考依據(jù)。