雞蛋清溶菌酶分離純化研究進展

明 輝，李 浩，徐 婷

（四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓644000）

0 引言

溶菌酶是一種對人體無毒無害的天然蛋白，可以作為一種抗菌蛋白，殺滅部分革蘭氏陽性菌，因此被廣泛應用于食品加工領域，作為食品防腐劑應用于食品保鮮、食品貯藏[1-2]等方面。由于其抗菌和抗生素，溶菌酶還可以提高免疫力和治療多發(fā)炎癥[3]。在禽類的飼料中添加少量溶菌酶，能夠抑菌防腐、延長飼料的貯存期，還可以提高禽類的抗病能力、存活能力和生長速度[4-5]。在包裝行業(yè)中，用經(jīng)溶菌酶處理的包裝紙包裝饅頭時，可以使其延長1周而不變味。因此，食品工業(yè)、動物養(yǎng)殖業(yè)和疾病防治等都需要大量的溶菌酶。據(jù)估計，全世界每年商業(yè)使用溶菌酶超過了100 t。而高純度、高活性溶菌酶一直是近年來食品與醫(yī)院界的研究熱點。

目前，雞蛋清溶菌酶分離純化的技術主要有兩大類，第一類是放大法，主要是采用超濾法、沉淀法、鹽析、離子交換法等；第二類為實驗室規(guī)模，主要有親和層析、色譜法、反膠束等。對雞蛋清溶菌酶分離純化技術近年來取得的成就進行綜述。

1 超濾法

1.1 超濾原理

超濾法是利用膜兩側壓力差，通過不同超濾膜的孔徑，將分子量不同的混合物進行分離，使小分子通過膜，而大分子被截留，從而實現(xiàn)對酶的純化[6]。該方法操作簡單方便，且酶不容易失活，但也存在膜易堵塞、操作時間較長等缺點。

1.2 超濾的基本過程

應用超濾法分離純化雞蛋清溶菌酶，一般采用兩步法，第一步將料液經(jīng)過50kDa的PES膜進行超濾，主要除去大部分雜蛋白，第二步再進行30 kDa PES膜超濾。由于超濾法分離蛋白質(zhì)受操作條件和物理化學條件的強烈影響，因此需要非常精確的過程才能有效分離蛋白質(zhì)，為了確定最佳的條件，可以通過改變壓力、攪拌速度、pH值等工藝參數(shù)。

1.3 影響因素

1.3.1 pH值

研究發(fā)現(xiàn)不同的pH值隨時間變化對分離特性有很大影響。Datta D等人[7]選擇3種不同的pH值下進行檢測。一種是低于卵清蛋白的等電點2.5，一種是高于卵清蛋白的等電點5.5；另一種是在卵清蛋白的等電點，即4.5。膜通量在pH值5.5時最小，由于蛋清中大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在4.5～5.5。因此，蛋白質(zhì)在pH值5.5時的總電荷是可以忽略的。又由于膜表面沉積的蛋白質(zhì)之間并無靜電斥力，沉積層變密集，濃差極化現(xiàn)象影響變大[8]，分子簇形成可能會阻礙溶質(zhì)分子的滲透[9]，進而造成膜通量減少。在pH值2.5的條件下，偏離了雞蛋清中的卵清蛋白等電點，使得卵清蛋白帶正電，而蛋清中大多數(shù)蛋白帶正電，保留了在表面的蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥作用，滲透量會很高，靜電斥力會降低濃差極化，降低膜阻力，從而產(chǎn)生更高的膜通量。在pH值4.5時，為雞蛋清卵清蛋白的等電點，溶液中蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力接近于零，蛋白質(zhì)分子處于離散化，在膜表面形成的凝膠導致蛋白質(zhì)的最大析出，從而使得膜通量較小，滲透濃度較低[10]。

1.3.2 跨膜壓力

壓力是影響膜通量的重要因素，由于施加在膜表面的驅動力變大，膜通量則會隨著操作壓力的增加而增大。隨著時間的推移，滲透通量先會迅速下降，然后逐漸下降，最終放平緩。在低壓力下，膜通量的下降速率會更快，這可能是由于膜表面的濃差極化形成了凝膠層，對膜通量產(chǎn)生了阻力。隨著驅動力的減小，濃差極化產(chǎn)生的凝膠層的厚度增加的更快。然而，壓力過大也會加速某些組分在膜中的沉積，造成膜孔減少甚至堵塞，最終使得膜通量和蛋白質(zhì)得率降低[11]。

1.3.3 攪拌速度

不攪拌的情況下，蛋白質(zhì)容易沉積在膜表面，導致濃差極化增大，膜通量和蛋白質(zhì)回收率降低。而研究發(fā)現(xiàn)通過增加攪拌，膜通量隨著攪拌次數(shù)的增加而增加，蛋白的回收率也逐漸提高，這是由于帶有高剪切裝置特性的膜表面的渦流增強。高通量可能的原因是攪拌時，靠近膜的進料也會旋轉，并將沉積的溶質(zhì)從膜表面給掃走，減低了濃差極化，同時增加了滲透速率。Datt D等人[7]研究表明，攪拌速率50～200 rpm，蛋白回收率從82.3%提高到了98.7%。

1.3.4 進料濃度

不同的進料濃度對滲透通量有不同的影響。初始濃度越高，通量下降的速率也會越快。并且容易形成顯著的膜污染，這是由于特定的膜-溶質(zhì)相互作用引起的[7]，而這些不溶物將會沉積在膜表面造成膜堵塞，從而導致膜通量的下降[12]。不管是表面沉積還是膜污染，膜的固有阻力都會發(fā)生變化，這是由于物理化學的相互作用。進料濃度對分離特性也會產(chǎn)生影響，雖然低進料濃度可以提高滲透速率，但滲透液中總蛋白和單個蛋白濃度會顯著降低，這主要是由于水相與蛋白質(zhì)分子的滲透。通過對進料濃度進行優(yōu)化，可以使?jié)B透通量和滲透蛋白濃度保持在滿意的范圍內(nèi)。

2 食鹽直接結晶法

2.1 結晶的基本原理

結晶是物質(zhì)在過飽和度或過冷度的驅動下從蒸汽、溶液或熔融體中以晶體形態(tài)析出的過程。該過程包括形核和晶體生長。目前，主要的結晶方法有批量結晶[13]、液-液擴散結晶[14]、蒸汽擴散結晶[15]和透析結晶[16]。該方法操作簡單，但花費時間較長，短則數(shù)天、數(shù)周，長則數(shù)月。

2.2 結晶的基本過程

雞蛋清溶菌酶結晶，是通過溶菌酶具有耐熱耐酸性，且在鹽溶液中易析出，通過調(diào)節(jié)工藝參數(shù)，讓蛋白溶液達到過飽和，從而使得溶菌酶形成晶體，并從溶液中析出來。結晶法是雞蛋清溶菌酶分離純化最為常用的方法，該方法先利用等電點沉淀，調(diào)節(jié)蛋清的pH值到4.5，再利用溶菌酶的熱變性加熱數(shù)分鐘，除去大量的雜蛋白后，加入NaCl作為沉淀劑，調(diào)節(jié)pH值至溶菌酶的等電點10.7。再加入溶菌酶晶種，進行誘導結晶。低溫下放置大概1周，觀察到析出大量溶菌酶晶體，從而實現(xiàn)與其他雜蛋白的分離。若要獲得純度更高的溶菌酶，可通過上述方法重復結晶。但蛋白質(zhì)晶體的形成，受到結晶條件的影響，結晶過程只要有細微偏差，晶體的質(zhì)量和得率都會受到很大影響。因此，為了得到高質(zhì)量的晶體和更高的產(chǎn)率，就有必要確定最佳的結晶條件。

2.3 影響因素

2.3.1 鹽濃度

研究表明，通過調(diào)節(jié)不同的鹽濃度，得到的晶體質(zhì)量有明顯差異，隨著鹽濃度的增加，溶菌酶得率會增加，這是因為鹽濃度的增加，增大了溶液的過飽和度，從而影響晶體的數(shù)量和質(zhì)量，但是隨著鹽濃度的增加，會在溶液中觀察到不規(guī)則晶體和海膽或球粒隕石的存在，過多的鹽會導致晶體質(zhì)量明顯下降。

2.3.2 溫度

不同的蛋白質(zhì)需要的結晶溫度不一樣[17]，由于溶菌酶的溶解度隨著溫度的升高而逐漸增大，故溶菌酶結晶在低溫下更易析出。然而，逐漸變化的溫度能使溶菌酶形成的晶體形貌較好，在恒溫下的晶體質(zhì)量與在逐漸變化的溫度相比，會出現(xiàn)更大的缺陷，如出現(xiàn)裂紋、易破裂等，并且純度較低[18]，故結晶最好在低溫下，且溫度逐漸變化下最好，這是因為晶體在形核區(qū)形核，在亞穩(wěn)區(qū)生長。通過控制溫度的變化，讓晶體達到理想生長區(qū)域，并且在低溫下溶菌酶能保持更好的活性。

2.3.3 pH值

通常情況下，晶體會在靠近蛋白溶液的等電點附近析出；相反，遠離等電點則不利。這是由于溶液pH值的改變會引起蛋白質(zhì)分子所帶電荷的改變，從而影響蛋白質(zhì)溶解度的改變[19]。而蛋清中的蛋白質(zhì)大多等電點都在4.5～5.5，而溶菌酶的等電點為10.5～11.0，故先調(diào)節(jié)其他雜蛋白的pH值，讓其析出。進行離心分離之后，再調(diào)節(jié)溶菌酶的等電點。

3 離子交換法

3.1 離子交換法的原理

離子交換法是應用離子交換劑分離蛋白溶液中的蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)分子帶有不同的電荷，其與離子交換劑的基團有不同的強弱結合能力，從而能夠實現(xiàn)不同蛋白的分離純化。根據(jù)蛋白溶液及其分離的要求，選擇合適的離子交換劑。

3.2 離子交換的過程

由于溶菌酶是堿性蛋白酶，因此一般使用弱酸性陽離子樹脂作為離子交換劑。這是由于弱酸性陽離子樹脂能夠與蛋白溶液中的陽離子進行結合吸附，從而產(chǎn)生離子交換作用。使用之前，對購買的樹脂進行預處理，即用3倍體積的95%乙醇浸泡24 h，然后對其中的無機雜質(zhì)用酸洗滌，有機雜質(zhì)用堿除去，洗至中性即可。再用4～5倍體積的蒸餾水中和樹脂[20]。將處理好的樹脂小心灌入柱中，再將蛋清液加入樹脂中使其充分吸附，并在4℃下緩慢攪拌，以達到吸附平衡，吸附完成后，通過離心去除上清液，收集樹脂，然后用蒸餾水進行洗脫，離心除去上清液，再加入鹽溶液，攪拌混合后，進行洗脫、離心，收集上清液。該方法具有樣品處理量大、回收率高、活性保持良好、分離周期相對較短、價格低廉、可自動化連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點，是目前分離純化溶菌酶的常用方法。

3.3 影響因素

3.3.1 離子交換劑的類型

姜馗[21]以D152型陽離子交換樹脂為介質(zhì)，通過對一系列參數(shù)的優(yōu)化，得到的溶菌酶回收率為86.6%，活性為20 000 U/mg，洗脫下來的溶菌酶純度達到了100%。李欣[22]用DEAE-纖維素陰離子交換層析法分離雞蛋清溶菌酶，得到的溶菌酶收率為60%，酶活為15 000 U/mg，溶菌酶純度超過99.5%。李宗孝等人[23]采用724型陽離子交換樹脂提取溶菌酶，選用1%的H2SO4溶液洗脫，溶菌酶收率為14%。宋宏新等人[24]采用724型陽離子交換樹脂提取蛋清溶菌酶，分別用了動態(tài)交換法和靜態(tài)交換法，吸附率分別達到了83.5%，74.8%，其回收率達100%。

3.3.2 溫度

通過分析不同溫度條件下溶菌酶的吸附情況，表明隨著溫度的增加吸附量會明顯增加。低溫不利于溶菌酶的吸附，在12℃以上的溫度時吸附量的增加趨勢會逐漸變緩[21]。

3.3.3 pH值

通過調(diào)節(jié)pH值范圍在4～10時，發(fā)現(xiàn)不同pH值時的樹脂對蛋清溶液進行吸附所得到的溶菌酶其純度都較高。研究還發(fā)現(xiàn)，不同的pH值對溶菌酶的收率和活力會有較大的影響，在pH值接近中性時比pH值偏酸或偏堿時得到的溶菌酶收率和活性要好[25]。這是由于溶菌酶是堿性蛋白，其等電點在10.7左右，故在偏酸性條件下較穩(wěn)定。

3.3.4 蛋白質(zhì)濃度

研究發(fā)現(xiàn)，對蛋清稀釋不同的倍數(shù)，溶菌酶的回收率會不同。當?shù)扒逡合♂?倍時，回收率為82.2%，當?shù)扒逡合♂?倍時回收率為84%[21]。當?shù)扒逑♂?倍或者2倍時，洗脫下來的所獲得的蛋白純度都較高，基本為溶菌酶，然而隨著濃度的逐漸降低，洗脫液所得到的溶菌酶純度就會變低，這是由于樹脂會吸附其他雜蛋白，破壞了樹脂與溶菌酶的專一性吸附。由此表明，當?shù)扒鍧舛冗m中時，樹脂所吸附到的溶菌酶的回收率就會增加。

4 親和色譜法

4.1 親和色譜法的原理

親和色譜法通常是色譜法中選擇最高的一種，利用酶和底物，或者抗原抗體的特異性相結合，將特異性結合的一方作為固定相，利用與固定相不同的親和度進行分離，并選擇性地吸附物質(zhì)，再通過洗脫分析所需物質(zhì)[26]。

4.2 親和色譜法的過程

通過制備親和層析介質(zhì)作為填料，然后進行平衡，將預處理的蛋清進行裝柱，進行專一性親和吸附，吸附后進行洗脫。在整個洗脫過程中有一個單一的色譜峰，表明在流動緩沖液中能有效洗脫被吸附的蛋白質(zhì)[27]。該方法操作簡單、選擇性高、分離出的蛋白能夠保持較好的活性等。

4.3 影響因素

4.3.1 pH值

和離子交換法類似，色譜法也同樣是在pH值偏中性時，溶菌酶的吸附量最大。在偏酸和偏堿性pH值條件下，溶菌酶的吸附明顯降低。表明介質(zhì)pH值對溶菌酶的吸附平衡有重要影響。pH值為7時，介質(zhì)與溶菌酶直接存在優(yōu)先的相互作用。這可能是離子交換和疏水相互作用的結果[28-29]。

4.3.2 鹽濃度

樹脂對溶菌酶的吸附量會隨著鹽濃度的增加而逐漸降低。這是由于隨著離子強度的增加，介質(zhì)對溶菌酶的吸附能力降低，這可能是由于介質(zhì)與溶菌酶之間的靜電相互作用減弱導致的[30]。一般選用的介質(zhì)都含有疏水基團和帶電基團，在吸附的整個過程中，這2種力就會相互結合。

5 萃取法

5.1 萃取原理

萃取法是通常分離液-液混合物的方法，是根據(jù)溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑里溶解度或分配系數(shù)的不同，使得溶質(zhì)從一種溶劑內(nèi)轉移到另外一種溶劑里提取出來的方法[31]。

5.2 萃取過程

萃取過程一般分為3步，即萃取、洗滌和反萃取。首先，將雞蛋清預處理，然后與萃取劑進行混合，充分振蕩，完成萃取。經(jīng)過離心將得到的液體相再加入鹽溶液，進行反萃取操作，之后離心、脫鹽、冷凍干燥得到產(chǎn)品。

5.3 影響因素

5.3.1 pH值

考慮到堿性條件可能會破壞溶菌酶的活性，故通過調(diào)節(jié)萃取體系的pH值2～9，發(fā)現(xiàn)pH值和離子強度的變化對萃取效率沒有顯著影響[32]。可能是由于溶菌酶所帶電荷在所研究的pH值范圍內(nèi)沒有發(fā)生變化，沒有靜電相互作用。因此，pH值和離子強度對萃取的影響可忽略不計。

5.3.2 萃取劑用量

隨著萃取劑用量的增加，萃取率先是逐漸增加，之后會略有下降，這可能是由于萃取劑和溶菌酶在頂部的相形成了聚集體。隨著萃取劑用量的增加，頂層相的體積相應增大，導致體系的相形成能力增強[32]。因此，聚集體會將更多的溶菌酶轉移到頂層。當萃取劑用量過多時，萃取的能力會受到抑制，這可能是由于萃取劑的相空間有限，趨于飽和，過量的萃取劑溶劑在水相中，導致萃取效率下降。

5.3.3 鹽濃度

鹽濃度也是影響萃取過程中的一個關鍵因素。鹽濃度提高，萃取率會得到明顯的提高，這可能是由于鹽的濃度增加，鹽析效果增加，疏水性增加，導致溶菌酶在低相中的溶解度降低。使得更多的溶菌酶遷移到了頂層。但當鹽濃度過多時，萃取率開始下降，可能的原因是隨著鹽濃度的進一步增加，頂部相的含水量被拖入到底部相，因此頂部相體積急劇減小，溶菌酶下降[31]。

6 其他方法

近年來，越來越多的研究者通過合成吸附劑來分離純化溶菌酶，如Wang X等人[33]使用了分子印跡技術對溶菌酶進行分離純化，通過以溶菌酶為模板，丙烯酰胺和甲基丙烯酸為功能單體，制備了Lys-MIPs[34]，然后通過Lys-MIPs柱，從蛋清中分離出溶菌酶。Chiu H T等人[35]報道了一種離子交換納米纖維膜，通過膜和攪拌細胞反應器直接從雞蛋清中純化溶菌酶。蛋白回收率為22.3%，再經(jīng)純化后回收率達80.5%。Cheng C Y等人[36]研究了一種環(huán)保型聚乳酸稻殼灰混合基質(zhì)膜用于純化雞蛋清溶菌酶，溶菌酶的回收率為70%，純度接近100%。Luo R P等人[37]采用磁性納米粒從新鮮蛋清中分離出溶菌酶，并考查了酶濃度、吸附時間、pH值、離子強度等因素，其含量達113±4.2 mg/g，酶活達16 370±46 U/mg。

7 結語

溶菌酶的用途十分廣泛，尤其是高純度、高活性的溶菌酶，需求量越來越大，其分離純化的工藝一直是研究者關注的熱點。近年來，雞蛋清溶菌酶的分離純化技術發(fā)展迅速，其方法也是多種多樣，可根據(jù)所需的要求采用不同的分離純化手段，以獲得更高質(zhì)量的溶菌酶。單一的分離純化方法，可能存在回收率低、純度不高等情況，因而更多的研究者會選用多種方法結合，如Ji S等人[38]通過連續(xù)使用沉淀法，后又經(jīng)離子交換、超濾等方法，對蛋清中的5種主要蛋白進行了分離，得到溶菌酶的純度高于90%，高于77%。又如，Chen C等人[39]開發(fā)了親和膜色譜和染料配體色譜法，用于溶菌酶的純化，其在規(guī)?；纳a(chǎn)中，取得了高效益，在工業(yè)上得到了廣泛的應用[40]。因此，研究者可以充分利用溶菌酶的耐熱性、耐酸性、溶劑性等特點，通過改進分離純化的手段，合理地將結晶法、色譜法、萃取法等結合使用，以達到有效的回收率和純度。