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      運(yùn)脾豁痰通腦方對(duì)腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠神經(jīng)和胃腸功能、生長激素釋放肽和小窩蛋白1表達(dá)的影響▲

      2021-12-08 01:54:42劉永輝高玉廣譚慶晶王天保韋甜露
      廣西醫(yī)學(xué) 2021年18期
      關(guān)鍵詞:小窩胃腸功能腦缺血

      劉永輝 高玉廣 卿 潔 譚慶晶 吳 鵬 王天保 韋甜露 劉 泰 陳 煒

      (廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病二區(qū),南寧市 530023,電子郵箱:liuyonghui626@126.com)

      急性腦血管疾病患者起病后可以發(fā)生多個(gè)器官功能損傷,其中胃腸道動(dòng)力功能障礙是腦缺血再灌注后的常見表現(xiàn)。腦缺血再灌注后腸道的屏障功能受損,消化道潰瘍、出血的發(fā)生率升高[1]。此外,胃腸功能損傷可加重原有腦部病灶的損傷,并可影響機(jī)體各器官功能[2]。目前,腦缺血再灌注后胃腸功能損傷的治療主要包括改善神經(jīng)功能、調(diào)節(jié)和保護(hù)胃腸功能,但是大部分患者仍出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的后遺癥,需要長期留置胃管鼻飼,生活質(zhì)量嚴(yán)重下降,需要長期陪護(hù)治療,這加重了家庭負(fù)擔(dān)。因此,尋找腦缺血再灌注后胃腸功能損傷的有效治療靶點(diǎn)對(duì)改善此病的預(yù)后意義重大。近年來,“腦腸同治”以及“腦-腸軸”理論備受關(guān)注,故本研究采用運(yùn)脾豁痰通腦方(自擬方)治療腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠,探討該方的神經(jīng)保護(hù)和胃腸功能調(diào)節(jié)作用,并檢測(cè)相關(guān)組織中生長激素釋放肽(Ghrelin)、小窩蛋白1的表達(dá)水平以探討其作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠90只,清潔級(jí),體重(440±20)g,20~21月齡,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK桂2009-0002)。所有大鼠在溫度為21℃~24℃、濕度為45%~55%的環(huán)境中飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,并隨意進(jìn)食和飲水。

      1.2 主要試劑及藥物 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)一抗稀釋液(碧云天生物公司,批號(hào):P0023A),內(nèi)參Mouse Anti-β-Actin(博士德生物,批號(hào):AC-15),BeyoECL Plus超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物公司,批號(hào):P0018),凝膠制備試劑盒(碧云天生物公司,批號(hào):P0012AC),十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)蛋白上樣緩沖液5X(博士德生物,批號(hào):AR1112),RIPA裂解液 (碧云天生物公司,批號(hào):P0013B),Ghrelin抗體(Abcam公司,批號(hào):ab95250),小窩蛋白1抗體(Abcam公司,批號(hào):ab32577)。運(yùn)脾豁痰通腦方(茯苓12 g、青皮10 g、黃芩15 g、膽南星5 g、石菖蒲15 g、皂莢10 g、地龍10 g、丹參15 g)為江陰天江藥業(yè)有限公司的免煎顆粒(規(guī)格:5 g/包)。

      1.3 主要儀器 電子分析天平(OHAUS公司,型號(hào):AR2140),轉(zhuǎn)印儀(長沙市三環(huán)電子設(shè)備廠,型號(hào):Mini-PROTEAN),微型超速冷凍離心機(jī)(德國貝克曼庫爾特公司,型號(hào):BEA21)。

      1.4 分組及模型制備

      1.4.1 分組:根據(jù)SPSS 17.0軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字進(jìn)行分組,分為假手術(shù)組(30只)和缺血再灌注后胃腸損傷組(60只)。

      1.4.2 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型:大鼠術(shù)前禁食、禁水12 h。通過腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉大鼠,然后將其仰臥位固定。對(duì)于缺血再灌注后胃腸損傷組大鼠,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后使用動(dòng)脈夾關(guān)閉,阻斷血流3 min后打開動(dòng)脈夾使血流再灌注;對(duì)于假手術(shù)組大鼠,僅單純分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

      1.4.3 腦缺血再灌注后胃腸損傷模型:大腦中動(dòng)脈缺血再灌注24 h后,再根據(jù)是否出現(xiàn)異常胃腸表現(xiàn)篩選腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠(此時(shí)為造模成功)。異常胃腸表現(xiàn)包括大鼠被毛失去光澤,豎毛,大便逐漸變軟,逐漸出現(xiàn)食量下降,體重減輕;大便稀軟,不成形,甚至溏瀉,肛周、尾根部污穢,或干或濕,被毛枯黃或散亂,貼邊,扎堆,對(duì)外界反應(yīng)遲緩。缺血再灌注后胃腸損傷組的60只大鼠均出現(xiàn)上述表現(xiàn),將其采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組各30只。

      1.5 干預(yù)方法 造模成功后自由飲水及進(jìn)食,3 d后開始進(jìn)行干預(yù)。(1)中藥組:以純凈水為溶媒,將運(yùn)脾豁痰通腦方制成等質(zhì)量混懸液,按每次380 mL/kg進(jìn)行灌胃, 1次/d,共14 d。(2)假手術(shù)組和模型組:給予灌胃蒸餾水(0.38 mL/kg), 1次/d,共14 d。灌胃結(jié)束后,對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,然后斷頭處死大鼠,剝離下丘腦、胃、結(jié)腸并迅速放入凍存管內(nèi),-196℃液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

      1.6 觀察指標(biāo)

      1.6.1 各組大鼠胃腸功能評(píng)估:灌胃期間記錄各組大鼠每日飲食量、腹瀉的次數(shù),并記錄灌胃結(jié)束后的體重,以評(píng)估大鼠的胃腸功能。

      1.6.2 各組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分:使用ZeaLonga 5分制標(biāo)準(zhǔn)[3]。其中,0分為無神經(jīng)缺失癥狀,1分為不能伸展對(duì)側(cè)前爪,2分為行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈,3分為向偏癱側(cè)傾倒,4分為不能自發(fā)行走、意識(shí)喪失。

      1.6.3 免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織的小窩蛋白1表達(dá)水平和胃組織的Ghrelin的表達(dá)水平:取出大鼠腦、胃組織,分別采用RIPA裂解液進(jìn)行裂解,勻漿,4℃下12 000 r/min離心5 min,去除沉淀,取上清液。在分光光度計(jì)上比色分析,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出各樣本的蛋白濃度。然后上樣,電泳,用聚偏二氟乙烯膜60 V進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移2 h。封閉液封閉1 h后,加入相應(yīng)的一抗過夜(一抗稀釋濃度均為1 ∶100)。次日漂TBS液洗膜3次后,加入二抗(稀釋濃度為1 ∶100)。加入發(fā)光液,膠片顯像,用Image J軟件分析圖像,實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。

      1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 各組大鼠胃腸功能指標(biāo)的比較 與假手術(shù)組相比,模型組、中藥組大鼠的體重降低、飲食量減少、腹瀉次數(shù)增加(均P<0.05);與模型組相比,中藥組的體重、飲食量均增加,而腹瀉次數(shù)減少(均P<0.05)。見表1。

      表1 3組大鼠胃腸功能指標(biāo)的比較(x±s)

      2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損,模型組和中藥組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分高于假手術(shù)組(P<0.05),而中藥組的評(píng)分低于模型組(P<0.05)。見表2。

      表2 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較(x±s)

      2.3 各組大鼠腦組織中小窩蛋白1的表達(dá)和胃組織中Ghrelin的相對(duì)表達(dá) 模型組和中藥組的小窩蛋白1和Ghrelin相對(duì)表達(dá)水平均高于假手術(shù)組 (均P<0.05);中藥組的小窩蛋白1相對(duì)表達(dá)水平低于模型組,而Ghrelin相對(duì)表達(dá)水平高于模型組(均P<0.05)。見表3。

      表3 3組腦組織小窩蛋白1和胃組織Ghrelin相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

      3 討 論

      中醫(yī)認(rèn)為卒中后胃腸損傷屬于“呃逆”“胃脘痛”“虛秘”和“泄瀉”。而卒中病為痰濁阻于中焦,升降失常,致腦脈阻滯不通。老年人脾失運(yùn)化,痰濁內(nèi)生,內(nèi)虛生風(fēng),風(fēng)痰阻絡(luò),腦竅不開,致使卒中,卒中后胃氣失和、氣機(jī)不暢、運(yùn)化失調(diào),引起“呃逆”“胃脘痛”“虛秘”“泄瀉”。故疏通經(jīng)絡(luò),健脾推行氣血,豁痰開竅是主要治療原則。本研究選用由茯苓、青皮、黃芩、膽南星、石菖蒲、皂莢、地龍、丹參制成的運(yùn)脾豁痰通腦方,觀察其對(duì)腦缺血再灌注后胃腸道功能障礙的改善作用。結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高,體重降低、飲食量減少、腹瀉次數(shù)增加(P<0.05),提示成功建立腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠模型。給予運(yùn)脾豁痰通腦方干預(yù)后,與模型組相比,中藥組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低,體重和飲食量減少,而腹瀉次數(shù)減少(P<0.05)。結(jié)合運(yùn)脾豁痰通腦方中,青皮可抑制胃腸道平滑肌收縮[4],黃芩的主要藥物成分除有抗炎作用,還能增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的活力,提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率,對(duì)腦卒中后腦部神經(jīng)修復(fù)起積極作用[5];膽南星、石菖蒲、皂莢三藥均有祛痰開竅作用,皂莢可通絡(luò),石菖蒲還有抗抑郁、營養(yǎng)腦部神經(jīng)的作用,現(xiàn)代藥理研究表明,這三藥均有針對(duì)心腦血管的作用[6-8];地龍、丹參活血通經(jīng),其中丹參有較強(qiáng)的清除自由基的作用,能有效保護(hù)胃腸黏膜,且其有效成分丹酚酸B有較好的腦保護(hù)作用[9]。因此,運(yùn)脾豁痰通腦方不僅可以減輕腦缺血再灌注引起的神經(jīng)功能損傷,還可改善胃腸道功能。

      小窩蛋白1是胞膜窖的標(biāo)志性蛋白,在調(diào)節(jié)血腦屏障功能中具有重要作用。目前已明確小窩蛋白1與卒中發(fā)生后的血腦屏障滲透性密切相關(guān)。Choi等[10]發(fā)現(xiàn),大腦中動(dòng)脈閉塞3 d后大鼠腦組織中小窩蛋白1的表達(dá)水平和血腦屏障破壞均達(dá)到峰值;認(rèn)為小窩蛋白1表達(dá)水平與缺血引起的血管源性腦水腫密切相關(guān),其在腦缺血損傷期間調(diào)節(jié)血腦屏障通透性中有重要作用。另有臨床研究表明,發(fā)病后8 h、24 h、48 h、72 h、1周,腦室出血患者腦脊液中小窩蛋白1水平顯著升高,且腦內(nèi)小窩蛋白1的表達(dá)與顱腦損傷的嚴(yán)重程度有關(guān),其或可作為顱腦損傷疾病預(yù)后的指標(biāo)[11]。本研究結(jié)果也顯示,腦缺血再灌注后胃腸道損傷的大鼠腦組織的小窩蛋白1表達(dá)水平升高;而給予運(yùn)脾豁痰通腦方干預(yù)后,中藥組大鼠腦組織的小窩蛋白1表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),降低小窩蛋白1的表達(dá)可改善腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障[12]。因此,推測(cè)運(yùn)脾豁痰通腦方可能通過調(diào)節(jié)小窩蛋白1的表達(dá)來改善血腦屏障的功能,從而減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷。

      Ghrelin是主要由胃基底部黏膜層X/A樣細(xì)胞分泌的一種新型腦腸肽激素,其結(jié)構(gòu)與胃動(dòng)素相似,還可廣泛表達(dá)于胃黏膜之外的器官或組織,如腦、腸等。除了促進(jìn)生長激素分泌,Ghrelin還具有促進(jìn)食欲和進(jìn)食活動(dòng)、促進(jìn)胃酸分泌和胃蠕動(dòng)等生理作用[13]。有研究顯示,外源性Ghrelin可以改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損,縮小梗死面積,并提高皮質(zhì)層神經(jīng)元的存活率[14-15]。本研究中,模型組大鼠胃動(dòng)力學(xué)降低的同時(shí)胃組織Ghrelin水平升高。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn),腦缺血大鼠在腦缺血早期胃動(dòng)力學(xué)顯著降低而血清Ghrelin水平升高,這可以解釋為早期缺血階段的代償反應(yīng)[16]。本研究中,給予運(yùn)脾豁痰通腦方干預(yù)后,中藥組大鼠腦組織的Ghrelin表達(dá)水平高于模型組(P<0.05),這表明運(yùn)脾豁痰通腦方可上調(diào)Ghrelin水平。血清Ghrelin的上調(diào)可預(yù)防腦損傷并增加腸道蠕動(dòng),從而減少胃黏膜屏障的損傷[17]。此外,Ghrelin還可通過調(diào)節(jié)活性氧、酶活性和線粒體基因表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡,在腦缺血再灌注損傷中具有顯著的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)[18]。因此,我們推測(cè)運(yùn)脾豁痰通腦方通過上調(diào)Ghrelin水平,從而調(diào)節(jié)活性氧、酶活性和線粒體基因表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而增加腸道蠕動(dòng),并減輕血腦屏障的破壞和腦缺血再灌注損傷。

      綜上所述,運(yùn)脾豁痰通腦方不僅可以減輕腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠的神經(jīng)功能損傷,還可改善胃腸道功能,其可能通過下調(diào)小窩蛋白1、上調(diào)Ghrelin的表達(dá)來發(fā)揮治療作用。

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