張文嶺 趙飛飛 趙 丹 杜國(guó)濤 張兆波 李蘭梅

(1 河北省滄州市人民醫(yī)院中藥房，滄州市 061000，電子郵箱:zhangwenling656@163.com；2 河北省滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院工會(huì)，滄州市 061013)

伴隨人們健康意識(shí)的提高，食用菌作為我國(guó)膳食食譜中重要的“藥食同源”食材，因具有改善機(jī)體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、降低膽固醇/血壓/血糖、增強(qiáng)免疫力及抗腫瘤效果[1]，受到越來越多的關(guān)注。竹蓀系鬼筆科竹蓀屬大型食用菌，又名竹笙、竹參和面紗菌，為寄生在枯竹根部的一種隱花菌類，其中長(zhǎng)裙竹蓀、短裙竹蓀、棘托竹蓀和紅托竹蓀4個(gè)亞種常供食用。竹蓀的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含多糖、蛋白質(zhì)、核酸、多肽、維生素、多酚和礦物質(zhì)等，其多糖提取物可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用[2]，因此其具有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。本研究選擇乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞HeLa、胃癌細(xì)胞MGC803和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo作為研究對(duì)象，分析竹蓀多糖對(duì)5種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，從而為竹蓀多糖的藥效學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持，也為食用菌的綜合開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞HeLa、胃癌細(xì)胞MGC803和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清(批號(hào)：19C111)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；高糖杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM；批號(hào)：16A14B97)購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：ABB210359)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；青霉素、鏈霉素混合液(批號(hào)：20200702)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(批號(hào)：20200617)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT；批號(hào)：M8180)和磷酸緩沖鹽溶液(批號(hào)：A8020)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO；批號(hào)：RNBF3184)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；氯仿、正丁醇均為分析純。竹蓀購(gòu)自江中食療科技有限公司。

1.2 器材 超凈工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，ELX800型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自中國(guó)HealForce公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；96孔培養(yǎng)板購(gòu)自無錫耐思生物科技有限公司，KDC-140HR型冷凍離心機(jī)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BILON-1000CT型多用途恒溫超聲波提取機(jī)購(gòu)自上海比朗公司。

1.3 竹蓀多糖的提取 將干燥的竹蓀除雜、粉碎、過篩(100目)，得到竹蓀粉末，加8倍體積95%乙醇浸泡24 h，抽濾、風(fēng)干、密封保存?zhèn)溆?。取竹蓀多糖粉末30 g，加入約33倍體積蒸餾水，于 70℃、500 W下超聲波輔助提取30 min，95℃水浴振蕩浸提1 h[3]。于4℃下4 000 r/min離心10 min取上清液，濃縮后加入 4 倍體積無水乙醇，4℃過夜。于4℃下4 500 r/min離心6 min取沉淀物，冷凍干燥后得竹蓀粗多糖。將 Sevage 試劑(氯仿 ∶正丁醇=4 ∶1)與糖液按1 ∶3體積混合，振搖30 min，靜置分層，取上層多糖溶液，重復(fù)2次[4]。將多糖溶液濃縮至1 ∶1后裝入透析袋(截留分子量8 000)中，蒸餾水透析 96 h，真空冷凍干燥后得到純化后的多糖。采用硫酸-苯酚法測(cè)定竹蓀多糖提取物的多糖含量達(dá)91.27%。

1.4 腫瘤細(xì)胞株的培養(yǎng) 取出凍存于液氮罐中的5種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇，即在37℃水浴鍋中迅速完全融化，于4℃下3 500 r/min離心5 min，棄去上清。分別將乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，宮頸癌細(xì)胞HeLa和胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基中添加1%青霉素、鏈霉素混合液，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)(37℃、5% CO2、飽和濕度)，每隔3 d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 腫瘤細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn) 5種腫瘤細(xì)胞均分為不同濃度竹蓀多糖組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)組接種腫瘤細(xì)胞并加入含不同濃度竹蓀多糖的培養(yǎng)基，空白對(duì)照組只加入等量完全培養(yǎng)基但不接種腫瘤細(xì)胞，陰性對(duì)照組接種腫瘤細(xì)胞但只加入等量完全培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5種腫瘤細(xì)胞，分別按1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板(200 μL/孔)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度(10、20、40、60 μg/mL)竹蓀多糖的培養(yǎng)基200 μL，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入不含竹蓀多糖的完全培養(yǎng)基200 μL。將5種腫瘤細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后棄去上清液，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每孔加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出各組腫瘤細(xì)胞，棄上清液后各孔加入DMSO 150 μL，搖床20 min;酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)為490 nm，記錄各組腫瘤細(xì)胞相應(yīng)吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算竹蓀多糖對(duì)5種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，以各腫瘤細(xì)胞空白對(duì)照組作為調(diào)零孔，實(shí)驗(yàn)組吸光度值=竹蓀多糖組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值，對(duì)照組吸光度值=陰性對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值，增殖抑制率=(1-竹蓀多糖組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100% 。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 竹蓀多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同濃度竹蓀多糖組間乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；除10 μg/mL竹蓀多糖組中干預(yù)48 h后的乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制率低于干預(yù)24 h后的增殖抑制率(P<0.05)，其他濃度竹蓀多糖組中均未觀察到乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(均P>0.05)。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同濃度竹蓀多糖組的乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制率均低于15%，未見隨給藥濃度增加及給藥時(shí)間延長(zhǎng)而產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用。見表1。

表1 干預(yù)不同時(shí)間后各濃度竹蓀多糖組乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 竹蓀多糖對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用 在給藥24 h、48 h、72 h時(shí)，20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL竹蓀多糖組的肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率均高于10 μg/mL竹蓀多糖組(均P<0.05)；而在給藥24 h、48 h時(shí)，40 μg/mL、60 μg/mL竹蓀多糖組的肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率均高于20 μg/mL竹蓀多糖組，在給藥72 h時(shí)，60 μg/mL竹蓀多糖組的肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率均高于20 μg/mL竹蓀多糖組(均P<0.05)。

在10 μg/mL、20 μg/mL竹蓀多糖組中，肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率均隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(均P<0.05)；而在40 μg/mL竹蓀多糖組，給藥72 h時(shí)的肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率高于給藥24 h時(shí)，在60 μg/mL竹蓀多糖組，給藥72 h時(shí)的肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制率均高于給藥24 h及48 h時(shí)(均P<0.05)。見表2。

表2 干預(yù)不同時(shí)間后各濃度竹蓀多糖組肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制率(x±s，%)

2.3 竹蓀多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖的抑制作用 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同濃度竹蓀多糖組間、組內(nèi)宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，抑制率均低于14%，未見隨給藥濃度增加及給藥時(shí)間延長(zhǎng)而產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用。見表3。

表3 干預(yù)不同時(shí)間后各濃度竹蓀多糖組宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖抑制率(x±s，%)

2.4 竹蓀多糖對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803增殖的抑制作用 除60 μg/mL竹蓀多糖組中干預(yù)24和48 h后的胃癌細(xì)胞MGC803增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余濃度竹蓀多糖組中不同時(shí)間點(diǎn)之間的胃癌細(xì)胞MGC803增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中在10～40 μg/mL濃度之間，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖抑制率逐漸增加(均P<0.05)。干預(yù) 24 h 后，與10 μg/mL相比，20、40 μg/mL竹蓀多糖組胃癌細(xì)胞MGC803的增殖抑制率逐漸增加(均P<0.05)；干預(yù)48 h后，20、40 μg/mL竹蓀多糖組胃癌細(xì)胞MGC803增殖抑制率高于10 μg/mL竹蓀多糖組(均P<0.05)；干預(yù)72 h后，20、40、60 μg/mL竹蓀多糖組胃癌細(xì)胞MGC803增殖抑制率高于10 μg/mL竹蓀多糖組(均P<0.05)。見表4。

表4 干預(yù)不同時(shí)間后各濃度竹蓀多糖組胃癌細(xì)胞MGC803的增殖抑制率(x±s，%)

2.5 竹蓀多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖的抑制作用 20、40、60 μg/mL竹蓀多糖組中，干預(yù)后48 h和72 h結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖抑制率高于干預(yù)后24 h的增殖抑制率(均P<0.05)。干預(yù)24 h后，不同濃度竹蓀多糖組間結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)48 h和72 h后，結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖抑制率隨著竹蓀多糖濃度增加而增高(均P<0.05)。見表5。

表5 干預(yù)不同時(shí)間后各濃度竹蓀多糖組結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖抑制率(x±s，%)

3 討 論

食用菌的藥用價(jià)值受到越來越多的關(guān)注，其藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、健胃、助消化、預(yù)防和輔助治療心腦血管疾病等方面[5]。食用菌多糖作為食用菌抗癌的主要活性成分，可在刺激抗體形成的同時(shí)，提高機(jī)體防御能力，同時(shí)降低腫瘤的發(fā)生率，并且可輔助化療藥物以增效[6]，常見灰樹花多糖[7]、白靈側(cè)耳多糖[8]、靈芝多糖[9]、松口蘑多糖[10]等食用菌多糖用于抗腫瘤的研究報(bào)告。近年來關(guān)于竹蓀多糖提取的研究很多[11]，但有關(guān)竹蓀多糖抗腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。

本研究分析竹蓀多糖對(duì) 5種腫瘤細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞MCF-7、肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞HeLa、胃癌細(xì)胞MGC803和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo)增殖的抑制作用，旨在為竹蓀多糖的藥效學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持，也為食用菌的綜合開發(fā)與利用提供參考。結(jié)果顯示，使用一定濃度的竹蓀多糖干預(yù)一定時(shí)間后，其在體外對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制率可達(dá)50%，且在干預(yù)24～72 h后，10～60 μg/mL濃度范圍內(nèi)的竹蓀多糖對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用具有一定的時(shí)間依賴性和濃度依賴性(均P<0.05)，提示其對(duì)肝癌細(xì)胞具有較好的抑制作用，這或可為臨床配伍使用治療肝癌提供一定的參考。此外，竹蓀多糖對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖抑制率未達(dá)到50%以上，但隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)和干預(yù)濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率有所增加，可達(dá)20%以上，這提示竹蓀多糖可能對(duì)上述兩種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，進(jìn)一步增加藥物濃度或延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間是否可獲得更好的抑制作用，需今后進(jìn)行更為深入的研究加以論證。

然而，竹蓀多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖抑制率均低于15%，且隨著竹蓀多糖干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)和干預(yù)濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率并無增加趨勢(shì)(均P>0.05)。竹蓀多糖具有多種生物活性，這與其多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，其單糖組分多為半乳糖、葡萄糖、甘露糖，還包括微量的葡萄糖醛酸、海藻糖和痕量的核糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等[12]。本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)竹蓀多糖的結(jié)構(gòu)、單糖組成及其醛酸等進(jìn)行檢測(cè)，尚不確定竹蓀多糖的腫瘤抑制活性對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和宮頸癌細(xì)胞HeLa的增殖抑制作用較差與此是否也有關(guān)聯(lián)，尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，竹蓀多糖對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2具有較好的增殖抑制作用，且具有一定的時(shí)間依賴性和濃度依賴性，其可能對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803和結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖也有一定的抑制作用，這或可為竹蓀多糖的綜合開發(fā)與臨床應(yīng)用提供一定的參考。