微小RNA-215調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路在急性呼吸窘迫綜合征炎癥反應(yīng)中的作用▲

王麗姝 莫玉珍 王 鋒 賴旭東

(廣東省廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院1 感染科，2 放療科，廣州市 510220，電子郵箱：wanglishuabcd@126.com；3 中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東省深圳市 518033)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是由各種原因?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而出現(xiàn)的以呼吸窘迫及頑固性低氧血癥為臨床表現(xiàn)的綜合征[1-2]。研究表明，ARDS的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體內(nèi)炎癥與抗炎反應(yīng)失衡導(dǎo)致肺泡-血管內(nèi)皮屏障破壞，從而引起肺泡充血、表面活性物質(zhì)合成障礙，局部呈現(xiàn)高凝狀態(tài)等有關(guān)[3-4]。因抑制失控的炎癥反應(yīng)對(duì)ARDS的治療具有關(guān)鍵作用，因而各種促炎信號(hào)通路細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)成為ARDS治療的研究熱點(diǎn)[5]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號(hào)通路是常見的促炎信號(hào)通路之一，其中TLR4與革蘭陰性桿菌外壁層的脂多糖結(jié)合后，通過激活下游多條信號(hào)通路激活NF-κB，NF-κB上調(diào)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18等各種促炎因子的表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6-7]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，與mRNA的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[8]。多種miRNA在急性肺損傷中存在異常表達(dá)，并且可能與ARDS的炎癥反應(yīng)有關(guān)[9]。但miRNA在ARDS中的具體作用及其作用機(jī)制目前尚無定論。因此，本研究探討miRNA-21通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)ARDS炎癥反應(yīng)的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡，體重50～100 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0003]。在室溫、濕度為55%～60%的條件下常規(guī)飼養(yǎng)小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：A549細(xì)胞由珠江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑：脂多糖、杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)購自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：L8880，XG-S63632)；水合氯醛購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：165252-70-0)；氯仿購自南京潤升石化有限公司(批號(hào)：MFCD00000827)；異丙醇購自上海寬任化工有限公司(批號(hào)：67-63-0)；TRIzol RNA分離試劑、磷酸鹽緩沖液所有原材料、胰蛋白酶、Lipofectamine 3000試劑、2.5%胰酶、細(xì)胞裂解液均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(批號(hào)：BH-S63734，XG-S63608，GDG-2016，L3000015，R001100，BC-WB-018-100mL)，其中，按說明書進(jìn)行磷酸緩沖鹽溶液配置后，高壓蒸汽滅菌，置于4℃環(huán)境下保存；DEPC水、胎牛血清、細(xì)胞凍存液(二甲基亞砜與胎牛血清的體積比為1 ∶9)購自南京森貝伽生物科技有限公司；高效RIPA裂解液原材料購自北京索萊寶科技有限公司，按說明書進(jìn)行配置備用；miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、(Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)、定量PCR試劑盒(Hifair?Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit)均購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、鼠IL-1β ELISA試劑盒、鼠IL-6 ELISA試劑盒、鼠IL-18 ELISA試劑盒均購自青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司；蛋白免疫印跡試驗(yàn)所需的各種試劑[蛋白Marker、陽性對(duì)照裂解液、電泳緩沖液、蛋白染脫色試劑盒、轉(zhuǎn)膜濃縮試劑盒、蛋白免疫印跡試劑盒、抗體、聚偏二氟乙烯膜、苯甲基磺酰氟、ECL plus發(fā)光試劑盒、脫脂奶粉、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)上樣緩沖液、二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒等]購自金斯瑞生物科技有限公司；中性樹脂購自哈靈生物科技有限公司；miRNA-215 mimics和miRNA-215 inhibitor購自吉滿生物科技有限公司。通過microRNA Database(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/search.shtmL)進(jìn)行PCR的引物設(shè)計(jì)。

1.1.4 主要設(shè)備：低溫冰箱購自安徽中科都菱商用電器股份有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋購自青島環(huán)保聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；FrontierTM小型多功能臺(tái)式離心機(jī)購自奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；電子肛門體溫計(jì)購自廣州市倍爾康醫(yī)療器械有限公司；超純水機(jī)(HHitech和泰系列)購自上海和泰儀器有限公司；1.5 mL EP管、2 mL EP管、10 mL EP管、10 μL移液槍吸頭、200 μL移液槍吸頭、1 000 μL移液槍吸頭、移液器、Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、HeraguardTMECO 超凈工作臺(tái)、Countess 3自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司； VORTEX05型渦旋混勻器購自上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司；UV7型紫外可見分光光度計(jì)購自梅特勒-托利多國際有限公司；樂普全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng) Lepgen-96購自購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；蛋白免疫印跡試驗(yàn)所需的儀器(微量加樣器、電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀等)購自金斯瑞生物科技有限公司；CellXpert? C170i細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Eppendorf公司；BHC-1300IIB2生物安全柜購自蘇潔醫(yī)療器械(蘇州)有限公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只小鼠分為脂多糖組和對(duì)照組，每組24只。動(dòng)物模型建立前一天晚上開始禁食，但仍可自由飲水。脂多糖組小鼠按5 mg/kg的劑量腹腔注射1 mg/mL的脂多糖溶液，對(duì)照組腹腔注射5 mg/kg的生理鹽水。注射后觀察兩組小鼠的一般狀況及生命體征的變化。24 h后使用10%的水合氯醛(5 mg/kg)麻醉兩組小鼠，麻醉完成后使用皮膚剪剪開小鼠胸部的皮膚，使用組織剪剪斷部分肋骨，打開胸腔充分暴露肺部，將周圍結(jié)締組織清理干凈后結(jié)扎右主支氣管，取出右側(cè)肺葉組織，立即將肺下葉置于-196℃的液氮中浸泡20 min，然后保存于-80℃冰箱中，用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2 肺組織炎癥因子的檢測(cè)：將100 mg上述肺組織剪碎，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，低溫電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，0℃充分裂解30 min，于4℃、12 000 r/min條件下離心20 min，取上清液置于1.5 mL EP管中，-80℃下保存。然后按照ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，檢測(cè)小鼠肺組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平。

1.2.3 肺組織miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：(1)RNA的提取。取出肺組織100 mg，于1 mL TRIzol RNA分離試劑中剪碎，低溫電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿后靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩1 min后靜置5 min，于4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上層無色水相于新的離心管并加入0.5 mL異丙醇混勻，置于-70℃環(huán)境中沉淀過夜，4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，使用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，震蕩后4℃、12 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，再重復(fù)以上操作一次，室溫自然風(fēng)干沉淀結(jié)晶后加入DEPC水充分溶解，置于-80℃冰箱中冷藏備用。(2)RNA純度和濃度檢測(cè)。使用紫外可見分光光度計(jì)UV7對(duì)所得到的RNA樣品進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)，以DEPC水為空白對(duì)照，當(dāng)吸光度(A)260/A280值在1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)判定為純度和濃度合適，可以進(jìn)行下一步PCR檢測(cè)。(3)反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的上游引物序列為5′-GAGGAAAGTGGCGGGGAG-3′，下游引物序列為 5′-CCAACCAGAGCTGAGTCCAAGTA-3′。配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括反轉(zhuǎn)錄buffer 2 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、dNTP 0.1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5 μL、DEPC水5 μL、RNA模板2 μL。在37℃ 60 min、85℃ 5 min、4℃持續(xù)的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用DEPC水稀釋5倍后于-20℃保存。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。miRNA-215的上游引物序列為5′-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3′ ，下游引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGG T-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-GGCTACAGCAACAGGGTG-3′，下游序列為5′-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3′。配制miRNA擴(kuò)增反應(yīng)體系，包括SYBR GREEN染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、dNTP 1 μL、Taq聚合酶 2 μL、待測(cè)樣品cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL。將配制好的反應(yīng)體系置于PCR分析系統(tǒng) Lepgen-96中，在95℃預(yù)變性10 min、95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸34 s循環(huán)40次的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。使用樂普全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng) Lepgen-96配置的計(jì)算機(jī)軟件獲取實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果。

1.2.4 肺組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：(1)蛋白質(zhì)的提取。方法同1.2.2。(2)蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。使用二喹啉甲酸法，按照說明書操作步驟檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。(3)電泳。按照說明書配制SDS-PAGE凝膠，在蛋白質(zhì)樣品中加入適量濃縮SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃水浴加熱3～5 min使蛋白質(zhì)變性充分，冷卻至室溫后上樣，100 V電壓恒壓電泳100～120 min，條帶跑至離邊緣0.5～1 cm為止。(4)轉(zhuǎn)膜。將聚偏二氟乙烯膜在甲醇中浸泡5 min激活后，將聚偏氟乙烯膜、海綿墊、濾紙、電泳膠按照順序制備成轉(zhuǎn)膜夾(注意不要產(chǎn)生氣泡，膜和膠要對(duì)齊)，電轉(zhuǎn)液稀釋10倍后，70 V恒壓電轉(zhuǎn)2 h。(4)封閉。將蛋白膜于Western洗滌液中漂洗1～2 min后加入Western封閉液室溫封閉2 h。(5)一抗孵育。吸盡封閉液加入一抗(稀釋比例為1 ∶1 000)，4℃下于搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過夜后，回收一抗，使用Western Blot洗滌液在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10 min，洗滌3次。(6)二抗孵育。吸盡洗滌液加入二抗(稀釋比例為1 ∶1 000)，4℃于搖床上緩慢搖動(dòng)孵育過夜后，回收二抗，使用Western Blot洗滌液在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10 min，共洗滌3次。(7)蛋白檢測(cè)。配制ECL 工作液A液及B液各1 mL，按照說明書使用凝膠成像儀成像后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，分析并計(jì)算各個(gè)條帶灰度值。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：使用含10%胎牛血清、100 U青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞，待細(xì)胞生長至融合度為85%時(shí)，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗，0.25%胰酶消化細(xì)胞后離心(1 000 r/min)5 min；將細(xì)胞沉淀加入新鮮的完全培養(yǎng)基并按照1 ∶3的比例進(jìn)行傳代，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為85%時(shí)，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗，0.25%胰酶消化細(xì)胞后離心(1 000 r/min)5 min，將細(xì)胞沉淀加入凍存液以重懸細(xì)胞，按40℃ 30 min、-20℃ 30 min、-80℃ 12 h進(jìn)行梯度降溫，最后于液氮中長期保存。實(shí)驗(yàn)共分為4組進(jìn)行，包括miRNA-215組、miRNA-215抑制組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。需要使用細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，即取出凍存細(xì)胞，37℃水浴復(fù)蘇，解凍后3 000 r/min離心5 min，使用磷酸緩沖鹽溶液漂洗細(xì)胞沉淀3遍后接種于完全培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3.2 脂多糖刺激A549細(xì)胞建立模型：miRNA-215組、miRNA-215抑制組、陰性對(duì)照組細(xì)胞復(fù)蘇后，使用胰酶消化，然后接種到6孔板上(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日待細(xì)胞融合度約為80%時(shí)加入100 ng 脂多糖(使用脂多糖時(shí)用無菌磷酸緩沖鹽溶液稀釋10倍)刺激4 h后，使用胰酶消化,收集細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取經(jīng)脂多糖刺激的A549細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞融合度為50%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，miRNA-215組、miRNA-215抑制組分別轉(zhuǎn)染miRNA-215 mimics、miRNA-215 inhibitor，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組僅加入標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染液(Lipofectamine 3000試劑)。轉(zhuǎn)染操作如下：將細(xì)胞置于不含血清的2 mL DMEM培養(yǎng)液中，其中miRNA-215組和miRNA抑制組分別在不含血清的DMEM培養(yǎng)基中分別加入2 μg的miRNA-215 mimics、miRNA-215 inhibitor，并加入4 μL的Lipofectamine 3000試劑，其他兩組加入4 μL的Lipofectamine 3000試劑；混勻后室溫放置20 min，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后再將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4 miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，使用0.25%的胰酶消化，經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后將細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)，每孔加入1 mL TRIzol試劑，冰上放置5 min后加入0.2 mL氯仿劇烈震蕩15 s，30℃孵育5 min，4℃、12 000 r/min下離心15 min，取上層無色水樣移入新的EP管中，加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫孵育30 min，4℃、12 000 r/min下離心10 min，留沉淀加入1 mL 75%乙醇，漩渦震蕩30 s，4℃、7 500 r/min下離心5 min，留沉淀于超凈臺(tái)中鼓風(fēng)干燥5 min，加入RNA溶解液，60℃水浴10 min后,用1%瓊膠電泳鑒定RNA樣品濃度和純度，濃度純度合適者于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)步驟同1.2.3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3.5 炎癥因子水平的檢測(cè)：取完成轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，使用胰酶消化后，4℃、2 000 r/min下離心5 min，磷酸緩沖鹽溶液清洗細(xì)胞沉淀3次，4℃、2 000 r/min下離心5 min，加入80 μL細(xì)胞裂解液冰浴30 min進(jìn)行裂解，之后0℃、10 000 r/min下離心10 min，采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度并檢測(cè)純度后于-80℃保存?zhèn)溆谩⑻崛∷玫募?xì)胞蛋白質(zhì)，按照ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作步驟檢測(cè)細(xì)胞模型的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3.6 TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：取完成轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，按照1.3.5的方法提取蛋白質(zhì)后，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)水平，具體步驟見1.2.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠的基本情況 對(duì)照組小鼠的一般狀況良好，飲食飲水、呼吸、活動(dòng)、精神狀態(tài)均正常。而脂多糖組小鼠在腹腔注射3 h后呼吸頻率加快，飲食飲水減少，活動(dòng)減少；隨著時(shí)間延長，小鼠癥狀逐漸加重，出現(xiàn)呼吸窘迫、發(fā)紺，精神狀態(tài)不佳，不再飲食飲水。以上結(jié)果提示脂多糖組小鼠出現(xiàn)ARDS癥狀，造模成功。

2.2 兩組小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)水平的比較 脂多糖組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)水平的比較(x±s，pg/mg)

2.3 兩組小鼠肺組織miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平的比較 脂多糖組小鼠miRNA-215的相對(duì)表達(dá)水平為146.78±18.56，低于對(duì)照組的216.43±12.43(t=15.275，P<0.001)。

2.4 兩組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 脂多糖組小鼠的TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 兩組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 兩組小鼠肺組織TLR4、NF-κB的蛋白表達(dá)情況

2.5 各組細(xì)胞miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平的比較 miRNA-215組、miRNA-215抑制組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平依次為265.87±21.32、31.03±7.23、143.54±13.45、187.55±15.85，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=204.739,P<0.001)。其中，陰性對(duì)照組的miRNA-215相對(duì)表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)；此外miRNA-215組、陰性對(duì)照組、miRNA-215抑制組的miRNA-215相對(duì)表達(dá)水依次降低(均P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有參考意義。

2.6 各組細(xì)胞炎癥因子水平的比較 陰性對(duì)照組的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(均P<0.05)，表明模擬ARDS細(xì)胞模型成功；miRNA-215組、陰性對(duì)照組、miRNA-215抑制組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 4組細(xì)胞炎癥因子水平的比較(x±s，pg/mg)

2.7 各組細(xì)胞TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 miRNA-215組、空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miRNA-215抑制組細(xì)胞的TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)。見表4、圖2。

表4 4組細(xì)胞TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 4組細(xì)胞中TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá)情況

3 討 論

ARDS是各種病因?qū)е路闻萆掀ぜ?xì)胞、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損而出現(xiàn)的急性肺損傷[10-11]。ARDS的臨床治療主要采取治療原發(fā)病、控制感染性炎癥、呼吸支持、防治并發(fā)癥等綜合措施[12-13]，但是效果有限，因此合理有效的治療方案成為研究的熱點(diǎn)。ARDS的發(fā)生可能是因?yàn)轶w內(nèi)促炎和抗炎機(jī)制出現(xiàn)失衡[4]，短時(shí)間內(nèi)大量炎性因子釋放，造成肺泡上皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮的炎性損傷[14]，肺泡內(nèi)物質(zhì)滲出形成透明膜造成肺組織呼吸功能受限[15]。因此，目前級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)機(jī)制也成為了ARDS的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究方向[16]。miRNA作為真核生物中常見的非編碼小分子RNA，能夠與靶基因的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[17]。miRNA在真核生物的多種信號(hào)通路基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮作用[18]，并且miRNA的這種調(diào)控不會(huì)影響到mRNA的穩(wěn)定性，是非常理想的治療靶點(diǎn)[19]。有研究表明，miRNA可能參與肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，例如孟建斌等[20]發(fā)現(xiàn)急性肺損傷小鼠血漿中的miRNA-146a呈高表達(dá)；徐媛等[21]發(fā)現(xiàn)腹腔注射脂多糖構(gòu)建的急性肺損傷小鼠模型中存在miRNA-181b的異常表達(dá)，miRNA-181b可能參與炎癥反應(yīng)的負(fù)性調(diào)控等。miRNA-215可能參與多種炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，但是目前關(guān)于miRNA-215是否與ARDS的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，以及miRNA-215在ARDS的炎癥反應(yīng)中的具體作用及其機(jī)制的研究均較少。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討miRNA-215對(duì)ARDS炎癥反應(yīng)的具體作用及其作用機(jī)制是否與TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。本研究中，腹腔注射脂多糖后，小鼠呼吸頻率加快、飲食飲水減少、活動(dòng)減少，且肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平升高，表明腹腔注射脂多糖后小鼠出現(xiàn)ARDS癥狀以及肺部的炎癥反應(yīng)，成功建立ARDS模型。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡是ARDS的重要病理生理過程，以肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞構(gòu)建ARDS細(xì)胞模型具有較好的價(jià)值。A549細(xì)胞為人肺腺癌細(xì)胞，屬于傳代細(xì)胞系，可穩(wěn)定地進(jìn)行傳代和培養(yǎng)。且A549細(xì)胞系具有理想的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生化特征，已經(jīng)成為公認(rèn)的用于構(gòu)建肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞模型的理想的細(xì)胞。因此，本研究利用脂多糖刺激A549細(xì)胞構(gòu)建ARDS細(xì)胞模型。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均高于空白對(duì)照組(均P<0.05)，即脂多糖刺激后A549細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的炎性因子過度釋放，符合ARDS的發(fā)生機(jī)制，這表明本研究成功模擬了ARDS細(xì)胞模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中脂多糖組小鼠的miRNA-215的相對(duì)表達(dá)水平低于對(duì)照組，而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照組的miRNA-215的相對(duì)表達(dá)水平也低于空白對(duì)照組，即無論是ARDS動(dòng)物模型還是ARDS細(xì)胞模型都出現(xiàn)了miRNA-215表達(dá)的下調(diào)。這表明ARDS發(fā)生時(shí)存在miRNA-215表達(dá)下調(diào)。

我們進(jìn)一步將miRNA-215 mimics、miRNA-215 inhibitor轉(zhuǎn)染至ARDS模型細(xì)胞，以探討miRNA-215 在ARDS發(fā)生機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示miRNA-215組、陰性對(duì)照組、miRNA-215抑制組的miRNA-215相對(duì)表達(dá)水依次降低(均P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有參考意義。與陰性對(duì)照組相比，miRNA-215抑制組的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平升高，而miRNA-215組上述炎癥因子水平降低(均P<0.05)，這表明miRNA-215表達(dá)下調(diào)可能與ARDS的炎癥反應(yīng)有關(guān)，而上調(diào)miRNA-215表達(dá)具有減輕ARDS炎癥的作用。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，脂多糖組肺組織的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(均P<0.05)，這提示ARDS的發(fā)生機(jī)制可能與TLR4/NF-κB通路有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miRNA-215組、陰性對(duì)照組、miRNA-215抑制組的TLR4和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次升高(均P<0.05)，這表明miRNA-215可以調(diào)節(jié)ARDS細(xì)胞模型的TLR4/NF-κB信號(hào)通路，即下調(diào)miRNA-215的表達(dá)可使得ARDS細(xì)胞模型的TLR4、NF-κB表達(dá)增高，而上調(diào)miRNA-215表達(dá)則會(huì)抑制TLR4、NF-κB的表達(dá)。由此推測(cè)miRNA-215可以通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路來調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達(dá)，從而參與ARDS的發(fā)生。

綜上所述，miRNA-215表達(dá)下調(diào)可能與ARDS的發(fā)病有關(guān)，其可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路以調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達(dá)。而上調(diào)miRNA-215的表達(dá)或可通過負(fù)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路來減輕ARDS的炎癥反應(yīng)，miRNA-215可以作為輔助治療ARDS的靶點(diǎn)之一。由于本研究樣本量有限，并且沒有針對(duì)miRNA-215表達(dá)水平的改變與各種炎癥因子、TLR4、NF-κB水平的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，今后仍需深入研究以證實(shí)miRNA-215在ARDS中的作用及其作用機(jī)制。