高效液相色譜法測定特殊膳食中的煙酸和煙酰胺

李 越，方亞莉

（山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030031）

煙酰胺與煙酸統(tǒng)稱為維生素PP，主要存在于動(dòng)物內(nèi)臟、肌肉組織中，水果、蛋黃中也有微量存在，在酵母、米糠、麥麩和肉類中含量豐富，是人體必需的13種維生素之一。煙酰胺在體內(nèi)與核糖、磷酸、腺嘌呤構(gòu)成輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ，它們是許多脫氫酶的輔酶，在體內(nèi)生物氧化中起脫氫和加氫作用，與很多代謝過程包括葡萄糖酵解、脂肪代謝、丙酮酸代謝和高能磷酸鍵的生成等有密切關(guān)系。煙酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺才能發(fā)揮上述作用。此外煙酸還有較強(qiáng)的外周血管擴(kuò)張作用[1]。人體內(nèi)煙酸不足時(shí)會(huì)影響糖的酵解、檸檬酸循環(huán)、呼吸鏈以及脂肪酸的生物合成，從而引起煙酸缺乏癥。

目前，煙酸和煙酰胺的檢測方法主要有微生物法[2]、高效液相色譜法[3]。微生物法需在無菌條件下操作，成本較高，檢驗(yàn)周期長，過程較復(fù)雜[4]。本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有設(shè)施條件，參照GB 5009.89—2016[5]中高效液相色譜法，選擇特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品作為試驗(yàn)材料，建立了HPLC測定特殊膳食中煙酸和煙酰胺的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌均衡型全營養(yǎng)配方粉；煙酸（來源：中國食品藥品檢定研究院，含量：99.9%）；煙酰胺（來源：SUPELCO，含量：99.9%）；鹽酸；氫氧化鈉；甲醇（色譜純）；異丙醇（色譜純）；庚烷磺酸鈉（優(yōu)級純）；高氯酸（體積分?jǐn)?shù)為60%）；實(shí)驗(yàn)用水為一級超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-2040高效液相色譜儀、超聲波提取器、OHAUS AR224CN電子天平、OHAUS DV215CD 電子天平和酸度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取混合均勻固體試樣約5.0 g（精確到0.01 g），加入約25 mL 45～50 ℃的水于150 mL錐形瓶中，將上述錐形瓶置于超聲波振蕩器中振蕩約10 min，充分溶解，靜置5～10 min， 并冷卻至室溫。待試樣溶液降至室溫后，用鹽酸（5.0 mol/L和0.1 mol/L）調(diào)節(jié)試樣的pH值至1.7±0.1，放置約2 min后，再用氫氧化鈉溶液（5.0 mol/L和0.1 mol/L）調(diào)節(jié)試樣溶液的pH值至4.5±0.1。將試樣溶液轉(zhuǎn)至100 mL容量瓶中，用水反復(fù)沖洗錐形瓶，洗液合并于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后經(jīng)濾紙過濾，濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜加壓過濾，用樣品瓶收集，即為試樣待測液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及工作曲線配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。準(zhǔn)確稱取煙酸及煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品各 0.01 g，分別置于10 mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成 1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作系列的制備。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液 2 mL至50 mL容量瓶中，用水稀釋定容，配制為40 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)檢測需要，將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋配制成濃度為0 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL和8.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃±0.5 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：檢測波長為261 nm；流動(dòng)相：甲醇70 mL、異丙醇20 mL、庚烷磺酸鈉1 g，用910 mL水溶解并混勻后，用高氯酸調(diào)pH至2.1±0.1，經(jīng)0.45 μm膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及檢出限

將配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液在上述儀器條件下進(jìn)行測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)、待測組分的濃度X為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。取0.03 μg/mL的煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，0.04 μg/mL的煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述儀器條件下進(jìn)行測定，由圖譜得信噪比約為3∶1，故煙酸的檢出限為30 μg/100 g，煙酰胺的檢出限為40 μg/100 g。定量限為檢出限的3倍，煙酸和煙酰胺的定量限分別為0.9 mg/kg、1.2 mg/kg。

表1 目標(biāo)化合物的線性回歸參數(shù)及定量限

2.2 方法回收率與重復(fù)性

分別稱取樣品5.0 g，加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中目標(biāo)化合物的加標(biāo)濃度如表2中所示。每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，按照前述方法處理并上機(jī)測定，計(jì)算平均回收率及RSD，結(jié)果見表2，目標(biāo)物的回收率為91%～102%，平均回收率為95%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%。

表2 煙酸和煙酰胺加標(biāo)回收率及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

本研究分別考察了7.952 0 μg/mL濃度水平的煙酸和8.519 2 μg/mL濃度水平的煙酰胺，分別在0 h、1 h、2 h、 4 h、6 h和8 h后進(jìn)樣，計(jì)算其RSD，煙酸RSD為0.12%，煙酰胺RSD為0.20%。表明方法精密度與穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC測定特殊膳食中煙酸和煙酰胺的方法，目標(biāo)化合物保留時(shí)間相對穩(wěn)定，線性關(guān)系、重復(fù)性、回收率、精密度和穩(wěn)定性等考察結(jié)果良好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室對特殊膳食中煙酸和煙酰胺準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測需求。