趙烜影，劉振民，雍靖怡，王國(guó)驕，李 楠

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

牛乳行業(yè)是全球最多樣化和發(fā)展最密集的乳制品行業(yè)，導(dǎo)致針對(duì)不同年齡人群的目標(biāo)乳制品配方多樣化，以滿(mǎn)足特定的營(yíng)養(yǎng)需求[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)，2020年全球乳產(chǎn)量達(dá)到8.6 億t，其中牛乳占總產(chǎn)量的85.37%，其次是水牛乳（11.06%）、山羊乳（2.07%）、綿羊乳（1.36%）和駱駝乳（0.20%）[2]。牛乳被認(rèn)為是重要的能量來(lái)源，并且含有必需的營(yíng)養(yǎng)素，是蛋白質(zhì)、碳水化合物（乳糖）、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、低聚糖、內(nèi)在免疫因子、免疫球蛋白、激素、酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等的來(lái)源[1,3]。作為人類(lèi)飲食中重要的蛋白質(zhì)來(lái)源，牛乳提供約32 g/L的蛋白質(zhì)[4]，在人體內(nèi)不同的功能機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、代謝和神經(jīng)元生長(zhǎng)以及腸道微生物組的建立和穩(wěn)定[5-7]。 由于蛋白質(zhì)含量高，牛乳被視為潛在生物活性肽的良好來(lái)源[3]。目前已知的乳源生物活性肽是由牛乳中的2 種主要蛋白質(zhì)酪蛋白（主要包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）和乳清蛋白（主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）分解而來(lái)[8]。盡管其他動(dòng)物蛋白和植物蛋白都含有潛在的生物活性序列，但乳蛋白仍是目前一系列生物活性肽的主要來(lái)源[9]。在過(guò)去的70 年里，已經(jīng)對(duì)乳蛋白氨基酸序列中存在的生物活性肽進(jìn)行了許多研究[10]。早在1950年，Mellander[11]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于酪蛋白的磷酸化肽的攝入可改善兒童的VD非依賴(lài)性鈣化。

生物活性肽被定義為對(duì)身體功能或狀況有積極影響并最終影響健康的特定蛋白質(zhì)片段[12]，最初它們?cè)隗w內(nèi)保持無(wú)活性乳蛋白的結(jié)構(gòu)，可通過(guò)蛋白水解釋放[13]，釋放的生物活性肽通常很小，包含2～50 個(gè)氨基酸殘基[14]。食物來(lái)源的生物活性肽具有有益健康的成分，除了正常的基本營(yíng)養(yǎng)作用外，還可以在人體中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[15]。生物活性肽被認(rèn)為是藥物的更好替代品，它們主要來(lái)源于天然食品并且沒(méi)有嚴(yán)重的副作用，因此成為治療長(zhǎng)期慢性疾病的最佳方法之一[16]。乳蛋白衍生的生物活性肽的產(chǎn)生和性質(zhì)已在許多文章中進(jìn)行了綜述，許多在牛乳中發(fā)現(xiàn)的肽已被證明會(huì)影響心血管、神經(jīng)、消化、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)[3,16]，同時(shí)顯示出抗微生物、抗血栓形成、抗高血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等功能特性和免疫調(diào)節(jié)活性[17-19]。

目前國(guó)際市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了含有乳源生物活性肽的產(chǎn)品。本文綜述近年來(lái)乳源生物活性肽的來(lái)源、生產(chǎn)方式及生物活性的相關(guān)研究進(jìn)展，概述乳源生物活性肽的應(yīng)用潛力。

1 乳源生物活性肽來(lái)源

乳源生物活性肽衍生自乳蛋白。在牛乳、綿羊乳、山羊乳和水牛乳中約80%的乳蛋白是酪蛋白。酪蛋白作為一種磷酸化蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)磷酸鈣的復(fù)雜膠束形式存在于乳中，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白是主要的酪蛋白組分[20]。β-酪蛋白經(jīng)纖溶酶酶解產(chǎn)生的γ-酪蛋白也可以形成生物活性肽[21]。在乳中，乳清蛋白含量約占20%，由β-乳球蛋白（50%）、α-乳白蛋白（20%）、血清白蛋白（10%）及乳鐵蛋白4 種主要蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）， 10%，主要為IgG1，IgG2、IgA和IgM含量較少）組成[22]。 乳中常見(jiàn)的多肽如表1所示。

表1 常見(jiàn)乳源生物活性肽[10]Table 1 Common milk-derived bioactive peptides[10]

2 乳源生物活性肽產(chǎn)生方式

乳中的生物活性肽可通過(guò)酶促水解或發(fā)酵過(guò)程獲 得[23-26]。除了通過(guò)常規(guī)蛋白酶酶解從天然蛋白來(lái)源生產(chǎn)生物活性肽以外，重組DNA技術(shù)已成功用于大腸桿菌中生產(chǎn)特定的肽或其前體[19,27-28]。

2.1 酶解

產(chǎn)生生物活性肽的最常見(jiàn)方式是通過(guò)酶水解蛋白質(zhì)。大量研究表明，消化酶水解乳蛋白可以產(chǎn)生具有生物活性的肽[29]。乳蛋白在體內(nèi)胃腸消化過(guò)程中通過(guò)消化酶可以分解出一系列生物活性肽，如乳清蛋白經(jīng)腸道內(nèi)的胰蛋白酶消化可產(chǎn)生具有ACE抑制活性的乳激肽Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg（ALPMHIR）[29]。ACE抑制肽是現(xiàn)階段關(guān)注度較高的生物活性肽，一些研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白酶解產(chǎn)物比乳清蛋白酶解產(chǎn)物具有更高的ACE抑制活性[19]。體外消化通常使用不同pH值的緩沖液，以獲得最佳的水解酶活性[30]。目前最常用到的蛋白酶有胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，通過(guò)單獨(dú)或組合使用水解酪蛋白或乳清蛋白等乳蛋白，從而產(chǎn)生生物活性肽[31-33]。有時(shí)為了模擬胃腸道消化，還會(huì)采用堿性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等蛋白酶與胃蛋白酶和胰蛋白酶一起進(jìn)行連續(xù)處理來(lái)釋放各種生物活性肽，包括環(huán)瓜氨酸肽、ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽和阿片樣物質(zhì)[19]。Mizuno等[34]測(cè)定用9 種不同的市售蛋白酶處理酪蛋白后水解物的ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)源自米曲霉的蛋白酶處理后酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高。

2.2 發(fā)酵

除了酶解消化外，另一種生產(chǎn)生物活性肽的方式是利用微生物的蛋白水解系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)酵[35]。部分微生物可以將乳蛋白水解成肽和氨基酸，作為其生長(zhǎng)所需的氮源，水解釋放的肽可以通過(guò)超濾或分子篩分離純化，生物活性肽的氨基酸序列可以通過(guò)色譜方法鑒定[27,36-37]。許多乳制品發(fā)酵劑都可以高度水解乳蛋白，因此在發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)過(guò)程中可以預(yù)期形成生物活性肽[27]。通過(guò)微生物水解牛乳蛋白，釋放出不同的生物活性肽，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道[38]。瑞士乳桿菌菌株能夠釋放抗高血壓肽，其中最著名的是ACE抑制性三肽Leu-Pro-Pro（LPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP），這些肽的抗高血壓能力已在一些大鼠模型和人體研究中得到證實(shí)[19,39]。用糞腸球菌發(fā)酵牛乳可產(chǎn)生抗高血壓的酪蛋白衍生肽LHLPLP和HLPLP[40]。酸乳中的細(xì)菌、干酪發(fā)酵劑和市售益生菌也被證明在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)在牛乳中產(chǎn)生不同的生物活性肽[19,39]。

2.3 重組DNA技術(shù)

目前采用重組DNA大規(guī)模生產(chǎn)生物活性肽的技術(shù)還處在探索階段，研究重點(diǎn)在于長(zhǎng)鏈肽的合成[41-42]。DNA重組技術(shù)在制備長(zhǎng)鏈肽方面具有高產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，抑制對(duì)宿主有害產(chǎn)物的表達(dá)是該技術(shù)目前最大的挑戰(zhàn)[43-44]。此外，抗菌肽對(duì)表達(dá)載體具有很強(qiáng)的抗菌活性，并且對(duì)蛋白酶的活性比較敏感[45]。通過(guò)融合蛋白或串聯(lián)基因的形式表達(dá)這些生物活性肽可能會(huì)克服部分限制，這可能抵消其固有的毒性并提高其表達(dá)水平[27]。

3 乳源生物活性肽的生物活性

3.1 對(duì)消化系統(tǒng)的影響

牛乳在體內(nèi)胃腸道消化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）[46]。Meisel等[47]在回腸造口術(shù)廢液中發(fā)現(xiàn)了CPP，證明這些肽產(chǎn)生于胃腸道消化過(guò)程，且能夠到達(dá)回腸遠(yuǎn)端。CPP因能夠促進(jìn)人體對(duì)鈣、鐵、鋅等礦物營(yíng)養(yǎng)素的吸收和利用而受到學(xué)者們的關(guān)注[46]。 現(xiàn)階段對(duì)于CPP的研究主要集中在早期齲齒預(yù)防[48]， 研究發(fā)現(xiàn)，CPP有助于牙釉質(zhì)齲損體的再礦化作用[49]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CPP可以增加大鼠骨密度，促進(jìn)神經(jīng)肽Y的表達(dá)，利于大鼠骨骼的發(fā)育[50]。

酪蛋白巨肽（caseinmacropeptide，CMP）是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶降解產(chǎn)生的一類(lèi)多肽，具有生物活性功能和獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性[51]。CMP化學(xué)結(jié)構(gòu)中磷酸基團(tuán)的 不同修飾作用產(chǎn)生的不同序列片段可支持不同的生物學(xué)功能[52]。CMP已被證明可以直接作為神經(jīng)遞質(zhì)，或刺激相關(guān)激素的釋放，調(diào)節(jié)胃腸道分泌，它可以抑制胃酸的分泌，通過(guò)釋放膽囊收縮素刺激胰腺分泌[53]。CMP還能通過(guò)刺激產(chǎn)生短期食欲的胃腸激素（如膽囊收縮素、胰高血糖素樣肽-1、肽YY）及長(zhǎng)期作用的激素（如瘦素和胰島素）兩類(lèi)外周食欲調(diào)控信號(hào)的釋放，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)機(jī)體食欲的調(diào)節(jié)作用[52]。

糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是一種含有唾液酸的活性糖基磷酸肽，由κ-酪蛋白被凝乳酶特異性水解其中的苯丙氨酸-蛋氨酸間的酰胺鍵得到，GMP肽鏈上糖基和磷酸基團(tuán)的不同造就了其多樣化的生物功能活性[51]。GMP可以通過(guò)下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的Toll樣受體4炎癥途徑以及阻止腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的共培養(yǎng)單層滲透性增強(qiáng)腸道的抗炎和屏障功能[54]。酪蛋白GMP中支鏈氨基酸含量較高，且?guī)缀醪缓奖彼帷⑸彼岬确枷阕灏被?，被視為苯丙酮酸尿癥患者的理想膳食[55]。此外，GMP被證明可以促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)，并增強(qiáng)腸道內(nèi)微生物多樣性，GMP的肽骨架對(duì)益生元活性也至關(guān)重要[56-57]。

3.2 對(duì)免疫系統(tǒng)的影響

3.2.1 抗菌作用

抗菌肽又稱(chēng)宿主防御肽，是生物界中廣泛存在的一類(lèi)生物活性肽，它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般由20～60 個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)多樣，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等多種生物學(xué)功能[46]。乳源生物活性抗菌肽因具有識(shí)別受感染的靶細(xì)胞、廣譜殺菌及天然安全性等優(yōu)勢(shì)受到關(guān)注，這些活性肽能夠破壞細(xì)菌的膜通透性[58]，抑制許多革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原體，如大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、蠟樣芽孢桿菌和葡萄球菌[59]。從乳鐵蛋白中分離出的乳鐵素可以抑制葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌[60]。

3.2.2 抗氧化作用

乳蛋白經(jīng)消化后可以產(chǎn)生具有抗氧化活性的多肽，這些肽由5～11 個(gè)氨基酸組成，包含疏水性氨基酸、脯氨酸、組氨酸、酪氨酸或色氨酸[61]。乳源抗氧化肽能通過(guò)多種途徑抑制脂質(zhì)氧化，包括使活性氧失活、清除自由基、螯合金屬離子、減少氫過(guò)氧化物和改變食品體系的物理性質(zhì)等，調(diào)整及改善機(jī)體生理功能，從而促進(jìn)人體健康[62]。Suetsuna等[63]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白水解得到的Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu（YFYPEL）乳源活性肽對(duì)超氧陰離子、羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基具有清除活性，這表明酪蛋白衍生的Glu-Leu序列對(duì)于上述自由基清除很重要。乳清蛋白的水解產(chǎn)物已被證明具有抗氧化活性，用堿性蛋白酶消化5 h能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)還原能力的水解產(chǎn)物[64]。Barac等[65]發(fā)現(xiàn)，干酪成熟過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有抗氧化作用的α-酪蛋白衍生肽和β-酪蛋白衍生肽。

3.2.3 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫系統(tǒng)在保護(hù)個(gè)體免受細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)或真菌感染和癌癥的侵害中起著核心作用[46]。生物活性肽對(duì)個(gè)體的免疫系統(tǒng)也具有積極的刺激作用[66]。酪蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞調(diào)節(jié)肽可通過(guò)刺激負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞抑制喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可用于肺癌的治療[67-69]。免疫調(diào)節(jié)肽PGPIPN是源于牛乳β-酪蛋白63～68位氨基酸殘基的六肽，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥順鉑的耐藥性[70]。由乳清水解得到的免疫調(diào)節(jié)肽HWP可顯著降低肝移植后菌血癥的發(fā)病率[71]。

3.3 對(duì)心血管系統(tǒng)的影響

3.3.1 抗血栓作用

具有抗血栓形成功能的生物活性肽具有減少或預(yù)防血凝塊形成的能力。纖維蛋白原在血液凝結(jié)中起重要作用，CMP可以抑制纖維蛋白原與血小板表面的糖蛋白受體結(jié)合，進(jìn)而防止血小板聚集[72]。Tu Maolin等[73]通過(guò)胰蛋白酶水解酪蛋白得到對(duì)凝血酶抑制率為76.25%的多肽，其中序列為HQGLPQEVLNENENLLR、FFVAPFPEVFGK、DEVPSER、YLGYLEQLLR的4 種肽來(lái)自于αs1-酪蛋白，序列為NMAINPSK、NAVPITPTLIVR、FALPQYLY的3 種肽來(lái)自于αs2-酪蛋白，序列為VLPVPQK、AVPYPQR、GPFPIIV的3 種肽來(lái)自于β-酪蛋白。

3.3.2 降壓作用

高血壓可引起中風(fēng)、心力衰竭、缺血性心臟病和腎臟疾病，腎素血管緊張素被認(rèn)為是重要的血壓調(diào)節(jié)劑，因此抑制腎素作用于血管緊張素原的ACE被廣泛用于治療高血壓[8]。目前已從牛乳、羊乳、駱駝乳和馬乳中鑒定出多種ACE抑制肽[26,74]。緩激肽分解后產(chǎn)物會(huì)與血管緊張素II產(chǎn)生協(xié)同作用，ACE抑制肽還可以防止緩激肽的分解，從而通過(guò)增加動(dòng)脈血管舒張作用來(lái)降低血壓[75]。當(dāng)用瑞士乳桿菌或釀酒酵母發(fā)酵牛乳時(shí)，β-酪蛋白會(huì)釋放出IPP、VPP和LPP 3 種三肽[39]。在臨床實(shí)驗(yàn)中，急性攝入高劑量的三肽后，血壓正常志愿者的血漿緩激肽濃度增加，并且含三肽的乳制品可以降低輕度高血壓人群的血壓[39,76]。

3.4 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響

參與活躍神經(jīng)系統(tǒng)、具有阿片樣活性的肽被稱(chēng)為阿片肽，阿片肽同鴉片（嗎啡）有相似的藥理[77]。阿片肽是具有激動(dòng)劑活性和拮抗活性的阿片樣物質(zhì)受體配體，牛乳中的阿片肽屬于外源性阿片肽[78]。α-酪蛋白和β-酪蛋白被認(rèn)為是外源性阿片肽的良好來(lái)源，來(lái)源于β-酪蛋白的β-酪啡肽7是第1個(gè)被鑒定出的阿片肽（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile）[79]。來(lái)源于β-酪蛋白的β-酪啡肽對(duì)大腦功能、鎮(zhèn)靜和嬰兒睡眠以及焦慮等行為的調(diào)節(jié)存在潛在影響[80]。還有研究顯示，β-乳球蛋白、免疫球蛋白、α-乳白蛋白、乳過(guò)氧化物酶、乳鐵蛋白等組成的乳清蛋白具有阿片樣活性[81]。

3.5 對(duì)骨骼健康的影響

乳源生物活性肽可以在體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、成熟和基質(zhì)礦化，因此可能對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有有益作用[82]。用三肽IPP長(zhǎng)期治療可提高人類(lèi)前成骨細(xì)胞存活率，進(jìn)而改善基質(zhì)礦化[83]。此外，水牛乳酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶-胰蛋白酶水解可獲得具有抗氧化和成骨細(xì)胞增殖活性的生物活性肽，其中NAVPITPTL通過(guò)激活磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路顯著增加成骨細(xì)胞分化，VLPVPQK通過(guò)抑制去卵巢大鼠的氧化損傷和骨吸收細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而表現(xiàn)出抗骨質(zhì)疏松作用[84-85]。

4 結(jié) 語(yǔ)

生物活性肽作為促進(jìn)健康的功能性食品受到研究人員的關(guān)注，但是該領(lǐng)域的發(fā)展受到缺乏創(chuàng)新技術(shù)、分離純化和臨床研究的限制。在后續(xù)的發(fā)展過(guò)程中應(yīng)該以蛋白質(zhì)組學(xué)、重組DNA技術(shù)及微生物發(fā)酵等新技術(shù)為依據(jù)，將各種生物活性肽表現(xiàn)出的促健康作用標(biāo)準(zhǔn)化。并且要鼓勵(lì)研究機(jī)構(gòu)加大對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)的投入，以測(cè)試其對(duì)人體的有效性。

乳源生物活性肽因其潛在的健康益處而成為商業(yè)功能性食品的熱點(diǎn)。迄今為止，對(duì)食源性生物活性肽降壓、礦物質(zhì)結(jié)合、抗齲肽的生理作用進(jìn)行了較為深入的研究，但食源性生物活性肽在預(yù)防和治療慢性疾病中的作用尚缺乏深入研究。肥胖癥及相關(guān)慢性疾病的治療應(yīng)關(guān)注對(duì)天然生物活性肽的研究，預(yù)計(jì)會(huì)有更多基于乳源生物活性肽的產(chǎn)品被用于干預(yù)各種代謝綜合征，例如影響高血壓、血脂水平、葡萄糖平衡和體重指數(shù)。乳源生物活性肽的新研究領(lǐng)域是與記憶有關(guān)的疾病和情緒控制，在這種趨勢(shì)下許多具有抗氧化和阿片樣物質(zhì)性質(zhì)的乳源生物活性肽值得進(jìn)一步研究。