丁 洋，楊志琦，丁 妮，張曉燕，李明皓

肝細(xì)胞肝癌(HCC)是最為常見的惡性腫瘤，該腫瘤有高發(fā)病率，高病死率，極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特質(zhì)[1-2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是目前研究比較清楚的一種惡性腫瘤產(chǎn)生遷移和侵襲的機制[3]。上調(diào)基因4(URG4)是大數(shù)據(jù)時代發(fā)掘出的一種全新的癌基因，研究表明，該基因能夠在多種類型的腫瘤中表達(dá)[4-5]。Hep3B細(xì)胞中能夠檢測到URG4高表達(dá)，并且具有正向調(diào)節(jié)Hep3B細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的功能[6]。因此，本研究擬研究下調(diào)Hep3B細(xì)胞內(nèi)URG4基因表達(dá)的水平，能否調(diào)節(jié)肝臟惡性腫瘤細(xì)胞的遷移，侵襲能力以及對EMT機制中關(guān)鍵蛋白TGF-β、E-cadherin表達(dá)的影響。為進一步了解肝癌的發(fā)生、發(fā)展提出新的思路，并對其診斷、治療提出新的觀點。

1 資料與方法

1.1 一般資料:人肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞系Hep3B購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco。靶向URG4的siRNA(siURG4)或非特異性對照siRNA(siNC)購自上海Genechem公司?；|(zhì)膠購自BD。TRIzol試劑購自美國Invitrogen。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)購自Takara。細(xì)胞裂解液RIPA和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天。PVDF膜購自美國Millipore?？筓RG4抗體和抗ACTB抗體購自德國Sigma?？笶-cadherin抗體和抗TGF-β1抗體購自Abcam。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體購自賽維爾。ECL檢測試劑盒購自賽默飛。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入Hep3B細(xì)胞，培養(yǎng)48小時。使用LipofectamineTM 3 000試劑將siUGR4和siNC分別轉(zhuǎn)染至Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后進行遷移、侵襲實驗；收集轉(zhuǎn)染48 h 的Hep3B細(xì)胞，分別進行定量PCR和Western blotting檢測。

1.2.2 定量PCR：按照試劑說明書，使用TRIzol試劑分別將各組細(xì)胞中的總RNA樣本進行抽提。提取的RNA用不含RNase的DNase預(yù)處理后，取2 μg RNA進行cDNA合成和定量PCR。PCR步驟為:①95℃變性，10 min；② 95 ℃變性，15 s；③ 60 ℃退火，60 min；④ 65 ℃引物延伸，5 s，循環(huán)44次。每個樣品進行3次分析，并使用ACTB基因表達(dá)水平為內(nèi)參。使用2-ΔΔCt的方法對基因相對表達(dá)水平進行計算。

ACTB上游引物:5′CCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTC 3′,下游引物:5′ CGTAGCACAGCTTCTCCTTAATGTCAC 3′。URG4上游引物:5′GATACGCCAGTGAACCCCTTAGAC 3′,下游引物:5′CAGCAGAAATGTATGGTAGTGGTTCTC 3′。

1.2.3 細(xì)胞遷移和侵襲檢測：通過劃痕試驗測定細(xì)胞的遷移能力。24孔板中分別接種表達(dá)對照siRNA、siURG4的Hep3B細(xì)胞約5×105個，培養(yǎng)至融合度大于90%。融合細(xì)胞生長到單層狀態(tài)時，在其表面使用無菌槍頭輕柔地快速劃痕，間隔24小時開始觀察細(xì)胞遷移狀態(tài)。使用Transwell(6.5 mm，康寧)評估細(xì)胞侵襲性。將細(xì)胞懸液吹打混勻后，加入200 μl含 5%FBS。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為(1×105細(xì)胞/cm3)并接種于預(yù)先使用基質(zhì)膠包埋的Transwell小室的內(nèi)室中，然后在下腔室中加入20%FBS的完全培養(yǎng)基500 μl。37 ℃，24 h。無水甲醛固定發(fā)生侵襲的細(xì)胞，然后進行結(jié)晶紫染色。隨機在顯微鏡下挑選5個視野，細(xì)胞計數(shù)器下完成侵襲細(xì)胞的計數(shù)。

1.2.4 Western blotting:分別收集2組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌三遍清除細(xì)胞碎片，加入含蛋白酶抑制劑PMSF的細(xì)胞裂解液RIPA。冰浴，30 min 裂解并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對總蛋白進行定量。6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行蛋白質(zhì)樣品的分離(20 μg)，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。將 TBST(含0.1%Tween-20)緩沖液配制好的5%脫脂奶粉加入PVDF膜中，室溫下封閉1 h。分別將膜與抗URG4抗體(1∶1 000)，抗E-cadherin抗體(1∶1 000),抗TGF-β1抗體(1∶500)和 抗ACTB抗體(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜。使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體(1∶5 000)和化學(xué)增強發(fā)光檢測試劑盒可視化目的蛋白條帶。使用圖像處理軟件ImageJ(National Institutes of Health開發(fā))對蛋白條帶進行灰度分析。以目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參ACTB的灰度值得到的比值表示目的蛋白相對含量。

2 結(jié)果

2.1 siURG4顯著降低Hep3B細(xì)胞內(nèi)URG4表達(dá)水平：定量PCR結(jié)果顯示，與siNC組相比，siURG4組細(xì)胞內(nèi)URG4 mRNA明顯降低(0.431±0.060與0.982±0.026,t=14.64,P<0.05)；Western blotting結(jié)果顯示，siURG4組細(xì)胞內(nèi)URG4蛋白水平同樣出現(xiàn)下調(diào)，顯著低于siNC組(0.177±0.041與0.948±0.094,t=12.99,P<0.05)。

2.2 敲降URG4基因?qū)τ贖ep3B細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響：細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，siNC組和siURG4組細(xì)胞24 h 遷移率分別為(71.2±4.5)%和(53.3±6.4)%，siURG4組細(xì)胞遷移能力顯著低于siNC組(t=3.975,P<0.05)。同樣，Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，siNC組和siURG4組細(xì)胞24 h 穿膜細(xì)胞數(shù)分別為197.8±22.64和131.2±18.1，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.137,P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.3 敲降URG4對Hep3B細(xì)胞內(nèi)TGF-β和E-cadherin表達(dá)的影響：Western blotting結(jié)果顯示，與siNC組相比，siURG4組細(xì)胞內(nèi)TGF-β蛋白水平明顯下降 (0.106±0.029與1.333±0.163,t=12.85,P<0.05)，而E-cadherin蛋白水平則明顯上升(0.904±0.082與0.664±0.086,t=3.514,P<0.05)。表明UGR4的表達(dá)可影響TGF-β和E-cadherin表達(dá)。

3 討論

近年來的數(shù)據(jù)表明，肝癌的發(fā)病率和病死率長期位居我國惡性腫瘤前列[7]。研究表明肝癌細(xì)胞具有較強的侵襲能力、易發(fā)生轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的特性與高病死率顯著相關(guān)。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)的過程，包括腫瘤細(xì)胞之間黏附能力減弱、運動能力增強、侵潤局部組織、 隨血管遷徙并定植在遠(yuǎn)處器官，而EMT是使腫瘤細(xì)胞具有侵襲性非常重要的因素[8]。TGF-β是目前研究EMT發(fā)生、發(fā)展較為透徹的信號傳遞通路之一。URG4基因位于人類7號染色體(7p13)，其不同亞型編碼有不同的蛋白質(zhì)[9]。研究表明,高表達(dá)的URG4蛋白被發(fā)現(xiàn)在許多實體腫瘤，并調(diào)控腫瘤的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)展,包括肝細(xì)胞癌[10]、胃癌[4]、卵巢癌[11]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[9]、乳腺癌[5]和非小細(xì)胞肺癌[12]。URG4基因在肝癌細(xì)胞與臨床肝癌組織中的過度表達(dá)與細(xì)胞的增殖、遷移能力相關(guān)。目前在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌基因URG4的作用機制研究較少。本研究通過RNA干擾技術(shù)敲降肝癌細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞內(nèi)URG4表達(dá)水平后，Hep3B細(xì)胞遷移率和24 h 穿膜數(shù)明顯降低，可能通過降低肝癌細(xì)胞運動能力，從而抑制了Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲能力。同時敲降肝癌細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞內(nèi)URG4表達(dá)水平后，改變了TGF-β和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，與之前的研究結(jié)果一致。TGF-β是一個具有多種功能的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞完成 EMT，并且上調(diào)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。研究表明，TGF-β既可以活化Smad2 /3形成Smad2 /3 /4 /復(fù)合物，經(jīng)PI3K/Akt 通路介導(dǎo)調(diào)控EMT的發(fā)生；也可以協(xié)同與胞外基質(zhì)蛋白層黏連蛋白laminin和LN-5，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT[13]。這表明URG4在肝癌中的功能發(fā)揮可能與KF-κB通路和TGF-β相關(guān)[6,14]。

綜上所述，Hep3B細(xì)胞內(nèi)URG4基因表達(dá)的多少與細(xì)胞遷移，侵襲能力相關(guān)。URG4調(diào)控細(xì)胞遷移侵襲過程涉及TGF-β和E-cadherin蛋白。然而目前關(guān)于URG4與TGF-β和E-cadherin蛋白之間的具體作用方式仍不清楚，具體的調(diào)節(jié)方式還需進一步研究證實。