黎忠,冼亮,李青云,唐愛星,劉幽燕

（廣西大學化學化工學院，廣西南寧 530004）

0 引言

近二十年，人口激增和經(jīng)濟發(fā)展導致全球能源消耗劇增，人們開始積極探索可替代傳統(tǒng)化石燃料的非常規(guī)能源以滿足需求。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)被認為是最有潛力的可替代能源之一。以蔗渣為例，它是甘蔗經(jīng)壓榨和提取蔗汁后得到的纖維狀殘留物，我國蔗渣的年產(chǎn)量超過500萬t，除少部分蔗渣被用于生產(chǎn)強度不高的紙張外[1]，大部分蔗渣被堆埋或焚燒，這不僅使這些原料沒有得到有效利用，還造成了嚴重的環(huán)境污染問題。目前，公認有效利用木質(zhì)纖維素的途徑是將木質(zhì)纖維素原料降解后生產(chǎn)糖類物質(zhì)[2]，糖類物質(zhì)再進一步轉(zhuǎn)化為生物燃料、精細化學品等。由此，木質(zhì)纖維素原料導致的環(huán)境污染問題可以通過對木質(zhì)纖維素原料的高附加值利用得到解決，木質(zhì)纖維素的開發(fā)和再利用也能部分替代傳統(tǒng)化石燃料，使能源短缺得到緩解。

木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等聚合物組成，這些聚合物彼此交聯(lián)纏繞，使得木質(zhì)纖維素具有抗降解的特性，也使其難以得到有效的水解。因此，木質(zhì)纖維素基發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料和化學品的瓶頸問題之一就是如何將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解為還原糖[3]。與化學、物理方法相比，酶法水解的優(yōu)勢在于副產(chǎn)物少、設備腐蝕少、能耗低和環(huán)境友好等，但是酶的降解效率低也成為影響該工藝工業(yè)化的限制因素。研究人員一直在開發(fā)各種可用于木質(zhì)纖維素水解的酶，采用復合酶體系是提高酶水解效率的策略之一，其中木聚糖酶與纖維素酶的協(xié)同增效作用得到了很多文獻報道的證實[4]。

木聚糖酶是一種半纖維素酶，可從木聚糖的均聚物主鏈中隨機切割出β-1，4-D-吡喃木糖單位，并將木聚糖降解為木糖和低聚木糖（Xylooligosaccharides，XOS）。由于低聚木糖是一種很有市場價值的益生元，因此將木聚糖酶用于協(xié)同木質(zhì)纖維素酶解可以帶來非?？捎^的經(jīng)濟效益。木聚糖酶可來源于動物或植物，但主要來自于微生物，包括如黑曲霉（Aspergillus niger）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、米根霉（Rhizopus oryzae）、揚氏青霉（Penicillium janczewskii）等絲狀真菌。

本課題組前期克隆所得的來自鏈霉菌的新型木聚糖酶Xyn10A已被證實可高效水解農(nóng)林業(yè)殘留物[5]，本文通過培養(yǎng)誘導重組大腸桿菌pET30a（+）-SipoEnXyn10A/E.coli Rosetta（DE3）并使用鎳柱純化法純化得到重組木聚糖酶Xyn10A，并將其應用于蔗渣的協(xié)同酶解，考察了蔗渣預處理方式和纖維素酶的種類對協(xié)同作用的影響，并通過響應面法對多酶體系的協(xié)同特性進行了初步探討。研究成果可進一步豐富蔗渣酶法降解的生物資源理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

纖維素酶C1184和C2730購買于Sigma公司，β-葡萄糖苷酶S10048 from almonds購買于上海源葉生物科技有限公司，重組菌pET30a（+）-SipoEnXyn10A/E.Coli Rosetta（DE3）為本實驗室克隆構(gòu)建所得，蔗渣由廣西博世科環(huán)?？萍加邢薰咎峁?，機械研磨后過60目篩，干燥后保存以進行后續(xù)的預處理。

1.2 實驗方法

1.2.1 木聚糖酶Xyn10A的純化

按照文獻[5]中的方法純化Xyn10A。在搖床（37℃，150 r/min）中培養(yǎng)含重組菌的LB培養(yǎng)基（氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L，pH調(diào)至7.0，121℃滅菌20 min）至菌體OD600濃度約為1.0，加入終濃度為1 mM的誘導劑IPTG，在搖床（18℃，100 r/min）中誘導12～16 h。誘導結(jié)束后，離心收集菌體細胞，然后重懸于含有10 mM的咪唑，300 mM的NaCl和50 mM的NaH2PO4（pH 8.0）的緩沖液中。通過ATS勻質(zhì)機破碎菌體，并使用Ni2+親和色譜法在10～500 mM的咪唑梯度下洗脫重組蛋白。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）測定重組蛋白的純度，并采用二喹啉甲酸法測定蛋白的濃度。純化后的Xyn10A洗脫液經(jīng)脫鹽濃縮后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 蔗渣的預處理

采用兩種方法對蔗渣進行預處理。第一種為AHPⅠ（Alkaline Hydrogen PeroxideⅠ）預處理：蔗渣與質(zhì)量分數(shù)為2% NaOH按1∶10的固液比混合均勻，并在121℃下蒸壓20 min，待反應混合物冷卻至室溫后加入質(zhì)量分數(shù)為5%的H2O2，密封后置于暗處靜置24 h[6]。第二種為AHPⅡ預處理：蔗渣與質(zhì)量分數(shù)為2%的H2O2和0.5%的MgSO4組成的混合溶液（用NaOH調(diào)節(jié)pH值為11.6）按1∶20的固液比混合均勻，并在60℃下水浴4 h[7]。反應完成后，AHPⅠ和AHPⅡ蔗渣用去離子水清洗至中性，并在50℃下干燥后密封保存?zhèn)溆?。不同預處理蔗渣的化學成分如表1所示。

表1 不同預處理蔗渣的化學成分Table 1 The chemical composition of sugarcane bagasse with different pretreatment

1.2.3 Xyn10A協(xié)同不同纖維素酶水解蔗渣

反應體系以AHPⅠ和AHPⅡ預處理蔗渣作為底物，底物含量為2%，反應液為2 mL的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值為6.0）。單Xyn10A酶組的酶用量（以單位質(zhì)量的底物計）為1 mg/g（37.5 U/g）的Xyn10A、單纖維素酶組的酶用量為0.5 FPU/g的C1184或C2730，協(xié)同酶組同時含有以上酶用量的相應酶。各組別反應體系置于水浴振蕩器（50℃，150 r/min）中水解24 h，設置滅活的酶組進行同樣操作作為空白對照。最終以二硝基水楊酸法測定還原糖量并計算協(xié)同程度。

1.2.4 協(xié)同酶酶用量的響應面設計

反應體系以AHPⅠ預處理蔗渣作為底物，底物含量為2%，反應液體積為2 mL。以C2730（X1），S10048（X2），Xyn10A（X3）的酶用量為研究因素，以產(chǎn)糖量和協(xié)同程度作為響應值，根據(jù)Design-Expert 8.0.6的響應面法進行3因素3水平的Box-Benhnken Design探究實驗。各組別反應體系均置于水浴振蕩器（50℃，150 r/min）中水解24 h，設置滅活的酶組進行同樣操作作為空白對照，每組設兩個平行實驗，結(jié)果取平均值。研究因素與水平值如表2所示。

表2 Box-Behnken Design考察因素與水平Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken Design

1.2.5 總酶用量對還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度的影響

反應體系設置底物濃度為2%，反應液體積為2 mL，以總酶用量為考察因素，協(xié)同酶組的各酶酶用量為C2730∶S10048∶Xyn10A=1∶1∶1，總酶用量設為1.5～72 mg/g。設置滅活的酶組進行同樣操作作為空白對照，每組設兩個平行實驗，結(jié)果取平均值。各反應樣品使用液相HPLC和蒸發(fā)光檢測器ELSD聯(lián)合檢測，并在測試時使用乙腈/水（體積比為85∶15）作為流動相，以2 mL/min的流速洗脫，待測樣品的進樣量為20μL，HPLC配備了Hypersil NH2色譜柱，該色譜柱柱尺寸為250×4.6 mm，粒徑為5μm，柱溫為30℃，使用蒸發(fā)光散射檢測器在溫度為40℃，載氣壓力為0.35 MPa的條件下檢測糖分。單糖產(chǎn)率的計算式為

式中：Y1+2為添加纖維素酶和木聚糖酶進行水解反應時的糖濃度，g/L；Y1和Y2分別為纖維素酶和木聚糖酶單獨水解時的糖濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 木聚糖酶Xyn10A的純化結(jié)果

將鎳柱填料純化Xyn10A所得洗脫液進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖1所示。

圖1 純化Xyn10A的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of purified Xyn10A

由圖1可看出，隨著洗脫液中咪唑濃度的升高，目的蛋白條帶開始出現(xiàn)，在第6，7泳道出現(xiàn)一條純度較高的條帶，該條帶的分子量約44 kDa，符合預計大小[5]。含0.2，0.3 M咪唑的洗脫液能夠?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?，洗脫行為也符合預計，說明Xyn10A得到成功純化。將0.2，0.3 M咪唑的洗脫液合并進行脫鹽和濃縮用于后續(xù)實驗。

2.2 不同來源纖維素酶對預處理蔗渣水解效果的影響

為了提高預處理蔗渣的水解效果，分別選用C2730和C1184與Xyn10A協(xié)同水解預處理蔗渣，結(jié)果見圖2。

圖2 Xyn10A分別與C2730或C1184協(xié)同降解預處理蔗渣Fig.2 Degradation of different pretreated bagasse by synergizes of Xyn10A with C2730 or C1184

從圖2可以看出，以不同預處理蔗渣為底物時，單C2730酶組的還原糖產(chǎn)量均明顯高于單C1184酶組，并且C2730與Xyn10A協(xié)同酶組降解AHPⅠ和AHPⅡ預處理蔗渣的還原糖產(chǎn)量分別為2.60，2.58 g/L，比C1184與Xyn10A協(xié)同酶組均提高了1.80倍。由此可見，反應體系即便添加了相同酶活單位的酶制劑，但由于酶制劑的來源不同，所含的輔酶成分不一，則反應獲得的還原糖產(chǎn)量也并不一定相同，這也進一步說明多酶協(xié)同反應的水解效率與各輔酶組分息息相關，輔酶組分的添加和水解效率的分析才能加深對多酶協(xié)同作用的了解，從而為更高效的混合酶制劑的制定提供參考[8]。此外，不同協(xié)同酶組在降解不同預處理蔗渣時，AHPⅠ預處理蔗渣均可以獲得最高的還原糖產(chǎn)量，可見不同底物的降解優(yōu)勢并不隨反應酶系的改變而改變。

就協(xié)同程度而言，C2730與Xyn10A協(xié)同酶組降解AHPⅠ和AHPⅡ預處理蔗渣的協(xié)同程度分別為1.71和1.79，相較于C1184與Xyn10A協(xié)同酶組的1.55和1.26，均得到提高，這說明相較于C1184，C2730與Xyn10A之間存在更明顯的協(xié)同作用。因此，在本文其后研究中均以C2730和Xyn10A組成協(xié)同酶組，并以具有最高還原糖產(chǎn)量的AHPⅠ預處理作為預處理方法。

2.3 多酶酶用量的響應面分析

考慮到多酶之間的協(xié)同作用是有交互作用的，而單因素實驗較難考察多酶之間的交互影響，故運用響應面法進行多因素探究。分別以C2730，S10048和Xyn10A的酶用量為考察因素，以還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度為響應值，進行三因素三水平的Box-Benhnken Design實驗來評估多酶之間的協(xié)同行為，實驗結(jié)果如表3所示。使用Design-Expert8.0.6軟件對還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度這兩項響應值進行ANOVA分析，在還原糖產(chǎn)量的回歸模型中，F(xiàn)值=356.64，p<0.000 1，說明模型具有顯著性；在協(xié)同程度的回歸模型中，F(xiàn)值=4.08，p=0.030 2，說明該模型同樣具有顯著性，故響應面模型可以很好地對實驗結(jié)果進行分析和預測[9]。

表3 Box-Benhnken Design實驗結(jié)果Table 3 Box-Benhnken Design experimental results

影響還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度的各因素的相互作用分別如圖3，4所示。

圖3 各酶酶用量對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of each enzyme loading on sugar production

由圖3可以看出：隨著C2730和Xyn10A兩酶酶用量的增加，還原糖產(chǎn)量持續(xù)增高，說明C2730和Xyn10A在協(xié)同水解過程中對還原糖產(chǎn)量的提升有積極作用，且C2730在提高還原糖產(chǎn)量上的作用優(yōu)于Xyn10A；C2730和S10048兩酶酶用量的增加對還原糖產(chǎn)量的增高展現(xiàn)出積極影響，而S10048酶用量的變化在促進還原糖產(chǎn)量提升方面的作用弱于C2730；Xyn10A和S10048兩酶酶用量的變化并未明顯改變還原糖產(chǎn)量。

由圖4可以看出：就協(xié)同程度而言，C2730與Xyn10A的交互影響作用比C2730與S10048的交互影響作用更明顯，說明C2730和Xyn10A之間的協(xié)同作用要比C2730和S10048的之間的協(xié)同作用更顯著；在協(xié)同程度的提升上，Xyn10A的影響效應比C2730和S10048更顯著。

圖4 各酶酶用量對協(xié)同程度的影響Fig.4 The effect of each enzyme loading on the degree of synergy

綜上可知，在C2730，Xyn10A和S10048的多酶混合體系中，3種酶酶用量的變化對還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度均有影響，但影響效果略有差異，C2730酶用量的變化對還原糖產(chǎn)量的影響作用最強，而Xyn10A是協(xié)同程度的最大影響因素。

2.4 酶用量對產(chǎn)糖和協(xié)同作用的影響

酶用量對單酶系統(tǒng)還原糖產(chǎn)量的影響如圖5所示?？偯赣昧繉Χ嗝竻f(xié)同系統(tǒng)（C2730，S10048和Xyn10A的酶用量之比為1∶1∶1）還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度的影響如圖6所示。

圖5 單Xyn10A酶和纖維素酶酶用量對還原糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of only Xyn10A and cellulase enzyme loading on sugar production

圖6 酶用量對還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度的影響Fig.6 Effect of total enzyme loading on sugar production and the degree of synergy

從圖5，6可以看出：單Xyn10A組、單纖維素酶組和協(xié)同酶組的還原糖產(chǎn)量均隨著酶用量的增加而持續(xù)增加；在最高酶用量下，各組的還原糖產(chǎn)量分別為1.68，11.98，17.41 g/L，協(xié)同酶組的還原糖產(chǎn)量相較于單纖維素酶組提高了45%，由此可見，Xyn10A的添加使得協(xié)同酶組的還原糖產(chǎn)量有顯著提高。隨著酶用量的增加，相較于單纖維素酶組和協(xié)同酶組，單Xyn10A組的還原糖產(chǎn)量的增長趨勢更為平緩，說明純木聚糖酶只有在協(xié)同體系中才能更好的發(fā)揮作用。

由圖6可以看出：協(xié)同程度隨總酶用量的增加而先增后減，最高協(xié)同程度1.88出現(xiàn)在總酶用量為24 mg/g時；當總酶用量小于24 mg/g時，還原糖產(chǎn)量和協(xié)同程度均隨著總酶用量的增加而增加，當總酶用量大于24 mg/g時，還原糖產(chǎn)量隨著總酶用量的增加而增加，而協(xié)同程度開始下降。這與Converse A O得出結(jié)論相一致[10]。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因：在低總酶用量下，底物對酶的有效結(jié)合位點處于盈余狀態(tài)，故此時增加酶用量能增加底物與酶的結(jié)合，從而增強酶對底物的有效水解，產(chǎn)糖和協(xié)同程度同時增加；在高總酶用量下，酶分子間的競爭結(jié)合作用會使協(xié)同程度下降[11]。

2.5 單糖產(chǎn)率分析

進一步對2.4節(jié)中協(xié)同酶組的反應樣品進行單糖產(chǎn)率分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶用量對單糖產(chǎn)率和協(xié)同程度的影響Fig.7 Effect of total enzyme loading on monosaccharide yield and synergy

從圖7可以看出：無論是葡萄糖還是木糖，隨酶用量的變化，單糖產(chǎn)率和協(xié)同程度均出現(xiàn)了相似的變化趨勢，即協(xié)同程度均隨著酶用量的增加而先增后減，單糖產(chǎn)率均隨著酶用量的增加而增加；在最高酶用量處，葡萄糖產(chǎn)率為84.83%，協(xié)同程度為1.36，木糖產(chǎn)率為81.67%，協(xié)同程度為1.17。

3 結(jié)論

①蔗渣的不同預處理方式和不同來源的纖維素酶均會影響協(xié)同酶解效果，采用不同來源的纖維素酶協(xié)同Xyn10A降解不同預處理蔗渣時，AHPⅠ預處理蔗渣均可以獲得最高的還原糖產(chǎn)量，底物的降解優(yōu)勢并不隨反應酶系的改變而改變。

②C2730，S10048和Xyn10A3種酶酶用量的增加對酶解還原糖產(chǎn)量的提升具有積極作用，C2730是還原糖產(chǎn)量的最大影響因子，而Xyn10A則是協(xié)同程度的最大貢獻者。在C2730酶用量不變的情況下，Xyn10A和S10048兩輔酶的交互作用不會明顯提升還原糖產(chǎn)量。

③協(xié)同程度隨酶用量的增加而先增后減，最高協(xié)同程度1.88出現(xiàn)在總酶用量為24 mg/g時。還原糖產(chǎn)量隨著酶用量的增加而持續(xù)增高，當總酶用量為72 mg/g時，協(xié)同酶組的還原糖產(chǎn)量為17.41 g/L，相較于單纖維素酶的11.98 g/L，提高了45%，相應的葡萄糖產(chǎn)率為84.83%，協(xié)同程度為1.36，木糖產(chǎn)率為81.67%，協(xié)同程度為1.17。