劉輝琦，杰永生，鄭 蕊，綦 惠，陳 磊，靳少鋒，舒 雄△

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.北京市創(chuàng)傷骨科研究所/北京積水潭醫(yī)院，北京 100035)

研究顯示，HSP90家族與腫瘤關(guān)系密切。該家族主要有HSP90α、HSP90β兩種同分異構(gòu)體，盡管二者同源性為84%，但生物學(xué)特性仍有所差別。目前認(rèn)為，HSP90α可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與腫瘤細(xì)胞的增殖，而HSP90β與腫瘤細(xì)胞分化相關(guān)。因此，盡管兩種異構(gòu)體在多種腫瘤中表達(dá)增加，但在不同腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)度有所差異。研究提示HSP90β在胃癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤等多種腫瘤中表達(dá)明顯增強(qiáng)[1，2]，與腫瘤侵襲、耐藥等相關(guān)[3，4]，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展及預(yù)后。為明確HSP90β與骨肉瘤侵襲的關(guān)系，本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的干擾及過(guò)表達(dá)探討HSP90β對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63侵襲的影響。

1.材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63(美國(guó)ATCC公司)；EMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-One qPCR Mix(美國(guó)GeneCopoeia公司)；感染試劑Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)；RNAzol?RT(美國(guó)Molecular Research Center公司)；小鼠抗人HSP90β單克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗人MMP2單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；PierceTMBCA Protein Assay Kit(美國(guó)Thermo公司)。其他相關(guān)生化試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

引物合成及測(cè)序由美國(guó)GeneCopoeia公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HSP90β的擴(kuò)增和干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及引物合成

提取MG-63基因組DNA，合成正向引物F-HSP90β(5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′)、反向引物R-HSP90β(5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′)，以基因組DNA為模板擴(kuò)增合成目的基因h-HSP90β的CDS區(qū)域。根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，按照人HSP90β基因的mRNA序列(GeneBank Accession No.NM_003299.1)設(shè)計(jì)shRNA靶序列和對(duì)照病毒載體序列(靶病毒序列：F 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；R 5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′。對(duì)照病毒序列：F 5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′；R 5′-CTGGAATAGCTCAGAGGC-3′)。

1.2.2 HSP90β干擾和過(guò)表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建

使用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)目的基因及慢病毒過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行酶切，并與pEZ-Lv201-eGFP-puro載體鏈接構(gòu)建HSP90β-pEZ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。將psi-LVRU6GP-eGFP-puro慢病毒干擾載體與shRNA模板鏈接構(gòu)建HSP90β-shRNA干擾質(zhì)粒。利用DH5α大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲取陽(yáng)性克隆并擴(kuò)增，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)及測(cè)序進(jìn)行鑒定及分析。

1.2.3 重組表達(dá)HSP90β慢病毒脂質(zhì)體的包裝

利用Lipofectamine 2000包裝pSPAX2和pMD2G質(zhì)粒，制備完成的重組慢病毒質(zhì)粒LVRU6GP-shRNA-HSP90β、HSP90β-pEZ轉(zhuǎn)入H1299細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后棄含有感染混合物的培養(yǎng)基，更換含10% FBS的新鮮完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清。補(bǔ)充完全新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集所有細(xì)胞上清，離心(4℃，2000r/min，10min)去除細(xì)胞碎片后再離心(4℃、20000 r/min，120 min)，所獲病毒原液分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 嘌呤霉素最小致死濃度(minimum lethal concentration，MLC)測(cè)定

用培養(yǎng)基將嘌呤霉素配制為梯度濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0μg/mL)篩選培養(yǎng)基。按4×104(20%～35%)個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)篩選培養(yǎng)基接種于24孔板，每個(gè)梯度設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，另有兩孔做不加藥對(duì)照。置培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)，兩天后換液，換液篩選濃度保持不變，以3天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最小嘌呤霉素濃度為最小致死濃度。

1.2.5 感染復(fù)數(shù)(multiply of infection，MOI)測(cè)定

用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中的15個(gè)孔，過(guò)夜培養(yǎng)(37℃，5% CO2)，達(dá)50%～60%的細(xì)胞匯合密度。病毒液以冰水浴融化，瞬時(shí)離心。將培養(yǎng)液(5%FBS完全培養(yǎng)基含雙抗)按5個(gè)MOI設(shè)定值(1、10、50、100、200)稀釋病毒原液。棄去96孔板中的培養(yǎng)基，加入不同設(shè)定值慢病毒稀釋液(100μL/孔)，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)(37℃，5% CO2，72h)。檢測(cè)各孔熒光細(xì)胞百分比。

1.2.6 MG-63細(xì)胞慢病毒感染

在24孔板上按2.5×105個(gè)/孔接種MG-63細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時(shí)，根據(jù)病毒感染復(fù)數(shù)和細(xì)胞量加入相應(yīng)體積的病毒原液置培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)培養(yǎng)24 h，更換無(wú)病毒的適應(yīng)性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5% CO2)24 h ，除去未感染病毒的細(xì)胞，用嘌呤霉素適應(yīng)性培養(yǎng)基(1μg/mL)培養(yǎng)(37℃，5% CO2)1周，殺死所有未感染病毒的細(xì)胞，使慢病毒感染細(xì)胞穩(wěn)定傳代。

1.2.7 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。用RNAzol?RT提取總RNA。用All-in-One First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄：37 ℃下預(yù)反應(yīng)60 min；85 ℃下擴(kuò)增5 min。引物序列F：GCGAGTCAGAGAAAACATTTG；R：AAAAGATACCCTGACCGAAGC。參照All-in-One qPCR Mix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性10 min；95 ℃下變性10 s，60 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.8 HSP90β對(duì)MG-63細(xì)胞侵襲的檢測(cè)

用胰蛋白酶消化、收獲對(duì)數(shù)增殖期的HSP90β-shRNA MG-63細(xì)胞和HSP90β-pEZ MG-63細(xì)胞。用Matrigel包被Transwell上室并以2×104個(gè)/孔接種細(xì)胞，下室加入含血清的完全培養(yǎng)基0.6 mL。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃，5% CO2，24h)，取下底膜，行DAPI染色，封片，置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.2.9 HSP90β及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)慢病毒載體HSP90β-pEZ鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示載體被切割成線性、插入片段堿基正確(圖1A-C)。測(cè)序顯示插入堿基序列與構(gòu)建的目的基因片段完全一致。

A：DNA Marker；B：HSP90β-pEZ plasmid；C：HSP90β-pEZ plasmid digested by BsrG and SalⅠ

2.2 干擾慢病毒載體HSP90β-shRNA鑒定

瓊脂糖凝膠電泳顯示載體被切割成線性、插入片段堿基正確(圖2A-C)。測(cè)序峰圖(圖2D)顯示干擾序列正確。

A：DNA Marker；B：HSP90β- shRNA plasmid；C：HSP90β-shRNA plasmid digested by AflI I and Sal I；D：HSP90β-shRNA gene sequence

2.3 嘌呤霉素最小致死濃度測(cè)定

結(jié)果顯示，慢病毒感染的MG-63的嘌呤毒素最小致死濃度為3μg/mL(圖3)。

圖3 慢病毒感染MG-63的嘌呤霉素最小致死濃度篩選圖(μg/mL)

2.4 慢病毒感染MG-63細(xì)胞MOI測(cè)定

結(jié)果顯示，感染復(fù)數(shù)為200時(shí)，80%的MG-63細(xì)胞被感染(圖4)。

圖4 慢病毒感染MG-63細(xì)胞感染復(fù)數(shù)篩選圖

2.5 MG-63細(xì)胞的HSP90β干擾和過(guò)表達(dá)慢病毒載體感染

感染復(fù)數(shù)為200時(shí)，80%的MG-63細(xì)胞被感染，最小嘌呤毒素致死濃度為3 μg/mL。結(jié)果顯示，干擾HSP90β-shRNA組熒光表達(dá)弱于干擾陰性對(duì)照組(NEG-shRNA)，過(guò)表達(dá)HSP90β-pEZ組熒光表達(dá)強(qiáng)于過(guò)表達(dá)對(duì)照組(NEG-pEZ)(圖5)。

圖5 慢病毒感染MG-63熒光鑒定圖

2.6 HSP90β干擾和過(guò)表達(dá)mRNA 和蛋白檢測(cè)

mRNA檢測(cè)顯示，HSP90β-shRNA組明顯低于NEG-shRNA組(P<0.01)，干擾效率為81.15%；HSP90β-pEZ組顯著高于NEG-pEZ組(P<0.01)(圖6)。蛋白檢測(cè)顯示，HSP90β-shRNA組明顯低于NEG-shRNA組，HSP90β-pEZ組明顯高于NEG-pEZ組(圖7)，各組HSP90β蛋白與mRNA相對(duì)表達(dá)水平一致。

**P<0.01

2.7 干擾及過(guò)表達(dá)HSP90β對(duì)MG-63侵襲的影響

Transwell小室檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)HSP90β-pEZ細(xì)胞侵襲數(shù)是HSP90β-shRNA細(xì)胞的1.6倍(274±23 vs 173±16)(P<0.01)(圖8～9)。

A.HSP90β-shRNA MG-63細(xì)胞 B.MG-63細(xì)胞 C.HSP90β-pEZ MG-63細(xì)胞

**P<0.01 *P<0.05

2.8 干擾及過(guò)表達(dá)HSP90β對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

用Western-blot法檢測(cè)干擾及過(guò)表達(dá)HSP90β對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示干擾HSP90β表達(dá)的MG-63骨肉瘤細(xì)胞中，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，MMP2、Snail表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞侵襲減弱，而過(guò)表達(dá)HSP90β的骨肉瘤細(xì)胞，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，MMP2、Snail表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)(圖10)。

**P<0.01

3.討論

骨肉瘤是骨骼系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，多發(fā)于青少年，具有惡性度高、早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[5，6]。目前新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)是骨肉瘤的主要治療方案，但發(fā)生轉(zhuǎn)移后5年生存率顯著降低，因此遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是影響骨肉瘤療效與預(yù)后的重要因素[7]。熱休克蛋白在所有真核細(xì)胞表達(dá)，是一類(lèi)細(xì)胞含量豐富、高度保守的分子伴侶，能夠防止或降低各種刺激對(duì)細(xì)胞引起的損傷，提高細(xì)胞生存率。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，癌細(xì)胞為了在惡劣環(huán)境中穩(wěn)定腫瘤相關(guān)蛋白并促進(jìn)自身的存活與增殖，往往會(huì)促進(jìn)HSP的表達(dá)，因而大多數(shù)腫瘤中的HSP表達(dá)都出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。HSP90是熱休克蛋白家族重要成員，在多種腫瘤中表達(dá)增高，以多種方式影響腫瘤生物學(xué)行為：①產(chǎn)生促自身生長(zhǎng)信號(hào)；②逃避細(xì)胞凋亡；③降低對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)的敏感性；④促進(jìn)血管生成；⑤獲得無(wú)限增殖能力；⑥促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移[8，9]。前期研究顯示，HSP90的兩個(gè)同分異構(gòu)體HSP90α、HSP90β在骨肉瘤中表達(dá)均增高，但HSP90β的陽(yáng)性率高于HSP90α(77.78% vs 57.78%)，且表達(dá)強(qiáng)度也高于后者[3]。

為進(jìn)一步研究HSP90β在骨肉瘤中的作用，本研究利用慢病毒載體構(gòu)建了干擾及過(guò)表達(dá)HSP90β的骨肉瘤MG-63細(xì)胞。借助于慢病毒構(gòu)建的慢病毒載體是高效的體外外源性基因傳遞工具，通過(guò)感染細(xì)胞，將目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組并穩(wěn)定表達(dá)，以此對(duì)目的基因進(jìn)行研究[10，11]。由于慢病毒具有感染效率高、免疫原性低的特點(diǎn)，使得慢病毒載體相關(guān)實(shí)驗(yàn)得到了廣泛的應(yīng)用[12]。本研究成功構(gòu)建了HSP90β干擾/過(guò)表達(dá)慢病毒載體，干擾序列正確，無(wú)突變，并可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨肉瘤MG-63細(xì)胞。轉(zhuǎn)染HSP90β干擾/過(guò)表達(dá)慢病毒載體，人骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲能力出現(xiàn)下降/增強(qiáng)，提示特異性抑制或者促進(jìn)HSP90β的表達(dá)可以抑制或促進(jìn)骨肉瘤的侵襲，表明HSP90β的表達(dá)與MG-63細(xì)胞的侵襲相關(guān)。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的包括多個(gè)相對(duì)獨(dú)立步驟的非連續(xù)性動(dòng)態(tài)過(guò)程，受腫瘤細(xì)胞本身的分子表型、生物學(xué)特性和宿主微環(huán)境等多種因素的影響。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏蛋白家族成員之一，生理?xiàng)l件下通過(guò)增加細(xì)胞間黏附力，抑制細(xì)胞增殖活動(dòng)，維持組織器官正常形態(tài)，但在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞間黏附作用減弱，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[13，14]。基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員MMP2具有分解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)明膠酶的作用，進(jìn)而造成局部溶解，為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[15，16]。Snail是一類(lèi)鋅指轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄抑制因子的生理功能，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可直接抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[17，18]。本研究結(jié)果提示HSP90β可以調(diào)節(jié)E-cadherin、MMP2及Snail的表達(dá)，骨肉瘤MG-63細(xì)胞高表達(dá)HSP90β，通過(guò)下調(diào)E-cadherin、上調(diào)MMP2及Snail的表達(dá)參與了骨肉瘤的早期轉(zhuǎn)移。