常 瓊，丘熠童，馬曉雨，常秀君，何 敏，夏曉曉，黎 婭，吳 穹#

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001；3.重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402360)

藏藥唐古特白刺果臨床用于改善2型糖尿病患者認(rèn)知功能[1]，但尚無(wú)依據(jù)。本研究利用唐古特白刺果提取物開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討其改善2型糖尿病大鼠認(rèn)知功能的作用，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料

SD大鼠〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006〕，4周齡，體質(zhì)量約100 g。唐古特白刺提取物(青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；檸檬酸鈉緩無(wú)菌緩沖液(Solarbio公司)；多聚甲醛(Wabcan公司)；TNF-α(Solarbio公司)；RAGE(Solarbio公司)；NFκB-P65(Solarbio公司)；IL-1β(Solarbio公司)；高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+10%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.3%膽酸鈉。北京博愛港公司)；鏈脲佐菌素(STZ，MeRcK公司)。-80 ℃低溫冰箱(Thermo Forma公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Heraeus公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

通過給予大鼠高糖高脂飼料結(jié)合STZ尾靜脈注射法建立。參照文獻(xiàn)[2]，將30只大鼠置同一環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)72 h，結(jié)束后隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組(NG，10只)、模型組(DE，20只)，分別用等量普通飼料、高脂飼料喂養(yǎng)。12 w后，在保證大鼠意識(shí)清楚的情況下，模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射STZ(25mg/kg)，NG組大鼠注射等劑量檸檬酸鈉無(wú)菌緩沖液。第7 d時(shí)取尾靜脈血測(cè)定血糖。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)血糖水平≥16.7 mmol/L。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥

將造模成功的20只大鼠隨機(jī)分為模型組(DM，10只)、治療組(DM+NTB，10只)后灌胃，治療組的灌胃物為唐古特白刺提取物(3.6/kg·d)，NG、DM組予以等劑量生理鹽水，持續(xù)4 w。

1.2.3 標(biāo)本收集及指標(biāo)測(cè)定

將大鼠禁食12 h，麻醉[腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)]，剝離海馬組織后迅速放入4%多聚甲醛固定液中，至少浸泡48 h。

1.2.4 HE染色

將海馬組織脫水、包埋、切片、染色，使用光鏡觀察大鼠海馬及皮層神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 免疫組化染色

海馬組織固定、包埋、切片過程同HE染色，按試劑盒說明行免疫組織化學(xué)染色。鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色或棕黃色。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 HE染色情況

光鏡下發(fā)現(xiàn)，NG組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列密集且較為平整，輪廓清晰，核膜連續(xù)無(wú)中斷，胞核多呈圓形。DM組細(xì)胞排列較NG組顯雜亂，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)斷裂且胞漿呈空泡狀，可見壞死的神經(jīng)元，其分布范圍廣。DM+NTB組細(xì)胞排布尚齊整，細(xì)胞間隙增大，可見散在的壞死神經(jīng)細(xì)胞，較DM組有改善。詳見圖1。

圖1 海馬細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化圖(HE染色×，400)

2.2 RAGE、NF-κB(p65)、TNF-α、IL-1β蛋白在海馬組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，RAGE產(chǎn)生的陽(yáng)性產(chǎn)物大多集中在細(xì)胞核；NF-κB(p65)、TNFα、IL-1β蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)。NG組海馬組織中的RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)少且分布區(qū)域局限；DM組RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-1β蛋白明顯增加且分布區(qū)域擴(kuò)大；DM+NTB組RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平介于NG和DM之間。詳見圖2～5。

圖2 RAGE在海馬組織中的表達(dá)圖(免疫組化染色，×400)

圖3 NF-κB在海馬組織中的表達(dá)圖(免疫組化染色，×400)

圖4 TNF-α在海馬組織中的表達(dá)圖(免疫組化染色，×400)

圖5 IL-1β在海馬組織中的表達(dá)圖(免疫組化染色，×400)

三組RAGE、NF-κB(p65)、TNFα、IL-1β蛋白表達(dá)(光密度值)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，兩兩比較，DM組高于NG組(P<0.05)；DM+NTB組介于NG組和DM組之間，其中DM+NTB組的RAGE、NF-κB(p65)、TNFα蛋白表達(dá)(光密度值)與NG組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DM+NTB組的RAGE、NF-κB(p65)、TNFα、IL-1β蛋白表達(dá)(光密度值)與DM組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。上述結(jié)果顯示，藏藥唐古特白刺果提取物可能通過抑制RAGE/NF-κB炎癥信號(hào)通路而起到保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的作用。

表1 三組蛋白表達(dá)水平

3.討論

本研究利用唐古特白刺果提取物開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，明確其具有改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的作用，且可能通過抑制RAGE/NF-κB信號(hào)通路改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能。

大鼠認(rèn)知能力出現(xiàn)異常與腦組織受損相伴[3]。有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激、AGEs增多和NF-κB(p65)、IL-1β、IL-6等蛋白升高因素構(gòu)成了DE發(fā)生的關(guān)鍵神經(jīng)病理基礎(chǔ)。本研究試圖探討唐古特白刺果通過抑制RAGE/NF-κB信號(hào)通路改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制。

目前已證實(shí)，隨著病情進(jìn)展，2型糖尿病患者伴發(fā)認(rèn)知障礙的可能性較高，后期可遷延至癡呆[4]。許多研究表明，糖尿病作為引發(fā)患者認(rèn)知功能減退和阿爾茲海默癥(AD)等病癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與AD的病理基礎(chǔ)存在較大相關(guān)性[5]，如AGEs及其受體RAGE不僅在T2DM動(dòng)物模型中表達(dá)增加，在AD中也會(huì)增加[6]。DE是指糖尿病患者隨著病情發(fā)展至影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的神經(jīng)病理學(xué)改變。大量基礎(chǔ)研究也證實(shí)DE的病理發(fā)展過程與晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增多、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗等多種因素關(guān)系密切[7]。

AGEs是葡萄糖和果糖自動(dòng)氧化產(chǎn)生的衰老蛋白質(zhì)衍生物，在重建組織和維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。但過量蓄積也會(huì)導(dǎo)致多器官組織產(chǎn)生病理改變，如導(dǎo)致機(jī)體處于持續(xù)的高血糖狀態(tài)，AGEs作為高血糖應(yīng)激產(chǎn)物相應(yīng)地快速累積，可導(dǎo)致凝血途徑異常，加速血栓形成，最終引起腦部疾病。RAGE在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，可通過蛋白修飾和降解AGEs降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷。AGES及受體RAGE可以通過多種機(jī)制引起神經(jīng)細(xì)胞的功能減退。AGEs與RAGE結(jié)合可引起氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)如IL-6、TNF-α等增加。這些細(xì)胞因子可破壞神經(jīng)元的正常生理進(jìn)程，使神經(jīng)元軸突、樹突數(shù)量減少，突觸可塑性減低，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。此外，上述機(jī)制還參與介導(dǎo)炎癥年齡效應(yīng)。AGEs能預(yù)生成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)[8]，并通過激活NF-κB通路，引起靶基因產(chǎn)物VEGF的產(chǎn)生[9]。新生血管、血腦屏障通透性和硬腦膜淋巴管的病理性改變是DM患者腦血管病變特征，即VEGF的生成與DE直接相關(guān)[10]。RAGE在組織中的過表達(dá)參與胰島素抵抗，而新陳代謝和胰島素信號(hào)水平異常可引發(fā)腦部疾病。有研究表明，RAGE和LRP-1的上下行調(diào)控不平衡可引發(fā)DM大鼠海馬和前額葉Aβ沉積，并進(jìn)一步加重認(rèn)知障礙[11]。關(guān)于天然化合物治療DE的研究已開展，目前發(fā)現(xiàn)小檗堿、黃芪提取物毛蕊異黃酮、姜黃素等具有顯著的抗氧化和抗炎作用，且已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明上述藥物能夠有效改善認(rèn)知能力。應(yīng)用具有保護(hù)神經(jīng)活性作用的天然藥物，有助于改善2型糖尿病患者腦神經(jīng)細(xì)胞退化和引發(fā)的認(rèn)知障礙。

本研究結(jié)果表明，唐古特白刺果能夠改善2型糖尿病大鼠的認(rèn)知障礙，提示其機(jī)制與抑制RAGE/NF-κB炎性信號(hào)通路有關(guān)。