王 珊，華玉美多，蘇姍姍，南星梅，楊占婷，蘆殿香，李占強(qiáng)*

[1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，青海 西寧 810001；3.西寧海關(guān)技術(shù)中心，青海省食品安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810003；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，青海 西寧 810001]

精氨酸酶(Arginase，Arg)通過(guò)與一氧化氮合酶競(jìng)爭(zhēng)底物L(fēng)-精氨酸來(lái)調(diào)節(jié)NO的生物利用度，Arg活性的增加和NO生物利用度的降低會(huì)引起內(nèi)皮功能障礙及其并發(fā)癥的發(fā)生[1，2]。因此，認(rèn)為Arg是治療內(nèi)皮功能障礙性疾病的潛在靶點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，唐古紅景天活性部位能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NO水平而發(fā)揮血管舒張活性，并能夠顯著干預(yù)低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成[3，4]?；诖?，本研究以精氨酸酶與唐古紅景天中部分化學(xué)成分的分子對(duì)接結(jié)果為基礎(chǔ)，虛擬篩選出抑制精氨酸酶的活性成分。并測(cè)定其中沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶的IC50、Ki、Ki′值，確定其對(duì)精氨酸酶的抑制活性及酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)類型。

1.材料與方法

1.1 主要材料與儀器

精氨酸酶(批號(hào)：M20A11Y120133，規(guī)格：BR，100μ/mg)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，沒(méi)食子酸(批號(hào)：J1120A)購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司)，尿素(Lot#：C11167159)、L-精氨酸(Lot#：C10882613)、2-異亞硝基苯丙酮(Lot#：C10239530)、氯化錳(Lot#：C11446505)均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，1M Tris·HCl(產(chǎn)品編號(hào)：ST776-100mL)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。全自動(dòng)酶標(biāo)儀分析系統(tǒng)(Infinite 200 Pro)購(gòu)于Tecan公司。

1.2 分子對(duì)接方法

1.2.1 結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(www.pdb.org)獲得精氨酸酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼：3KV2)。配體分子三維結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得，共獲取唐古紅景天中11個(gè)單體化合物的3D結(jié)構(gòu)，包括沒(méi)食子酸、絡(luò)塞、大花紅天素、酪醇、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、槲皮苷、異槲皮苷、表兒茶素、阿魏酸、咖啡酸和木犀草素。

1.2.2 分子對(duì)接操作

受體蛋白的處理：使用PyMOL軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)中自帶的小分子結(jié)構(gòu)；使用AutoDockTools軟件給蛋白分子進(jìn)行加氫處理；計(jì)算電荷并進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，保存為PDBQT格式。小分子的處理：利用AutoDockTools軟件給配體分子進(jìn)行加氫、加電荷處理；判定配體分子的Root，選擇配體分子中可扭轉(zhuǎn)的鍵，并保存為PDBQT格式。

1.3 精氨酸酶抑制活性

1.4 精氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)

對(duì)酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，分別設(shè)置25、50、100 mM三種L-精氨酸底物濃度，25、50、100、200 μM四種沒(méi)食子酸終濃度，進(jìn)行如1.3所述的精氨酸酶抑制活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。動(dòng)力學(xué)模型(米氏模型)用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行擬合，并繪制Lineweaver-Burk圖。將Lineweaver-Burk圖中不同直線的斜率與沒(méi)食子酸濃度進(jìn)行線性回歸，獲得沒(méi)食子酸與精氨酸酶的抑制常數(shù)Ki，將Lineweaver-Burk圖中不同直線與縱軸的截距同沒(méi)食子酸濃度進(jìn)行線性回歸，獲得沒(méi)食子酸與“精氨酸酶-精氨酸”復(fù)合物的抑制常數(shù)Ki′。

2.結(jié)果

2.1 分子對(duì)接

使用分子對(duì)接法分析唐古紅景天中11個(gè)主要化學(xué)成分與精氨酸酶蛋白3KV2的結(jié)合力，并對(duì)獲得的各化學(xué)成分結(jié)合能量最低的構(gòu)象進(jìn)行分析。對(duì)接結(jié)果如表1所示，結(jié)合自由能低于-5.0 kcal/mol的化學(xué)成分有沒(méi)食子酸、木犀草素、表兒茶素、咖啡酸、槲皮苷、阿魏酸、絡(luò)塞，分別為-5.80、-5.75、-5.73、-5.53、-5.36、-5.29、-5.14 kcal/mol。

表1 唐古紅景天主要化學(xué)成分與精氨酸酶靶點(diǎn)的分子對(duì)接評(píng)價(jià)表

續(xù)表：

用Discovery Studio Visualizer 2017軟件進(jìn)一步分析靶蛋白與配體的相互作用及結(jié)合模式，結(jié)果如圖1所示。圖1A～G中，左圖為三維結(jié)合模式圖，右圖為二維結(jié)合模式圖。其中具有最小結(jié)合自由能的沒(méi)食子酸，通過(guò)酚羥基和羧基與精氨酸酶ASP173、LYS223相互作用形成3個(gè)氫鍵(圖1A)；木犀草素可通過(guò)酚羥基和羰基與精氨酸酶TYR265、LYS88相互作用形成2個(gè)氫鍵(圖1B)；表兒茶素可通過(guò)酚羥基和醇羥基與精氨酸酶PRO20、GLY22、GLU25、SER16、ALA56相互作用形成5個(gè)氫鍵(圖1C)；咖啡酸通過(guò)酚羥基和羧基與精氨酸酶LYS172、LYS223、LEU219相互作用形成3個(gè)氫鍵(圖1D)；槲皮苷通過(guò)酚羥基和糖基與精氨酸酶PRO20、LYS191、ASP57、ASN69相互作用形成4個(gè)氫鍵(圖1E)；阿魏酸通過(guò)羧基與精氨酸酶LYS68、TYR218、GLY194相互作用形成3個(gè)氫鍵(圖1F)；絡(luò)塞通過(guò)糖基與精氨酸酶ASP158、VAL159、VAL165相互作用形成3個(gè)氫鍵(圖1G)。此外，酪醇、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、異槲皮苷和大花紅天素也能夠與精氨酸酶殘基相互作用形成氫鍵，但其結(jié)合自由能高于-5.0 kcal/mol。因此，進(jìn)一步對(duì)結(jié)合自由能最小的沒(méi)食子酸測(cè)定了其對(duì)精氨酸酶的IC50、Ki、Ki′及酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)類型。

圖1 化學(xué)成分與精氨酸酶靶蛋白3KV2的3D與2D結(jié)合模式圖

2.2 沒(méi)食子酸抑制精氨酸酶活性測(cè)定

尿素濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mg/mL時(shí)，以尿素溶液濃度為橫坐標(biāo)，顯色后550 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，獲得尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[Y=0.718X+0.0371(R2=0.997)]。

當(dāng)沒(méi)食子酸終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μM時(shí)，其精氨酸酶抑制率分別為26.11±1.01%、29.62±2.14%、36.04±2.30%、43.07±2.62%、60.44±2.61%，確定其IC50為124.3 μM。以終濃度為橫坐標(biāo)、精氨酸酶抑制率為縱坐標(biāo)獲得沒(méi)食子酸量效曲線圖(圖2A)。

圖2 沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶的濃度-反應(yīng)曲線

2.3 精氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定

以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得Lineweaver-Burk曲線圖(圖2B)，結(jié)果顯示，隨著沒(méi)食子酸濃度的升高，最大反應(yīng)速率Vm值在減小，米氏常數(shù)Km值在增大，各直線在第二象限相交(逆時(shí)針?lè)较?。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，由Lineweaver-Burk圖中不同直線的斜率為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(圖2C)，獲得抑制常數(shù)Ki為106.70 μM，由Lineweaver-Burk圖與縱軸的截距為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(圖2D)，獲得抑制常數(shù)Ki′為193.61 μM，抑制常數(shù)Ki′/Ki=1.81，表明沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶具有混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

3.討論

精氨酸酶是由Kossel和Dakin于1904年在哺乳動(dòng)物肝臟樣本中首次描述的一種金屬酶[6]，與一氧化氮合酶擁有共同的底物L(fēng)-精氨酸。精氨酸酶引起的L-精氨酸水平降低可限制NOS產(chǎn)生NO的水平[7]，這與內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的損傷密切相關(guān)[8]。此外精氨酸酶產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸的增加與血管平滑肌細(xì)胞增生和血管纖維化也密切相關(guān)[9，10]。有關(guān)精氨酸酶的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明[11]，精氨酸酶過(guò)度激活是內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵因素，是多種心血管疾病和與血管功能障礙相關(guān)的代謝和炎癥性疾病的潛在致病因素。

精氨酸酶的表達(dá)和活性升高與肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary Hypertension，PH)關(guān)系密切，其中PH與Arg2的表達(dá)增加有關(guān)[12-14]。同樣，NO水平的降低與精氨酸酶表達(dá)/活性的增加有關(guān)[15]。Kao等[16]利用放射性同位素研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶活性高的PH患者表現(xiàn)出NO水平顯著下降，而且不能通過(guò)增加L-精氨酸來(lái)彌補(bǔ)。內(nèi)皮功能障礙的主要特征是內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，特別是在氧化應(yīng)激和(或)炎癥增強(qiáng)的情況下，血管擴(kuò)張劑NO的生物利用度降低[17]。此外，Watts等[18]在實(shí)驗(yàn)性肺栓塞模型中發(fā)現(xiàn)，Arg2的增加制約肺內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張。而經(jīng)精氨酸酶抑制劑的治療可以提高NO水平，從而降低肺阻力并減輕低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓癥狀[19，20]。因此Arg和eNOS之間存在的雙向關(guān)系可能在肺動(dòng)脈高壓等血管性疾病中發(fā)揮重要作用[21]，抑制精氨酸酶活性已成為治療肺動(dòng)脈高壓等疾病的治療策略。

因此，尋找能夠有效抑制精氨酸酶活性的天然化合物將成為治療和預(yù)防血管性疾病的新策略[22-23]。李更兄等[3]在離體的肺血管環(huán)中，篩選獲得了唐古紅景天舒張血管的活性部位，并確定其內(nèi)皮依賴性的舒血管機(jī)制。南星梅等[4]進(jìn)一步對(duì)該活性部位進(jìn)行了體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其能夠干預(yù)低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成及肺血管的重構(gòu)，并明確了唐古紅景天舒張血管活性部位的主要化學(xué)成分[24]?；谏鲜鲅芯砍晒?，我們對(duì)唐古紅景天主要化學(xué)成分是否具有精氨酸酶抑制活性進(jìn)行了研究。本研究運(yùn)用分子對(duì)接方法，對(duì)唐古紅景天活性部位與精氨酸酶的相互作用進(jìn)行了研究，并對(duì)結(jié)合自由能最低的沒(méi)食子酸進(jìn)行了精氨酸酶抑制活性研究，確定其對(duì)精氨酸酶的IC50。根據(jù) Lineweaver-Burk圖模型可得到Ki與Ki′值[25，26]，其中Ki和Ki′分別是抑制劑與酶和“酶-底物”復(fù)合物結(jié)合的抑制常數(shù)。對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其Ki=Ki′；對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其Ki′/Ki→∞；對(duì)于混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其Ki′/Ki≠1[23]。本研究中沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶的抑制常數(shù)Ki和Ki′分別為106.70、193.61 μM(Ki′/Ki=1.81)，因此判定沒(méi)食子酸是精氨酸酶的混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，顯示它與底物L(fēng)-精氨酸、精氨酸酶形成了“酶-底物-抑制劑”三元復(fù)合物。De Oliveira等[27]證實(shí)沒(méi)食子酸具有內(nèi)皮依賴性的血管擴(kuò)張作用，并顯示了由內(nèi)皮介導(dǎo)的發(fā)生機(jī)制。本研究進(jìn)一步確定了沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶的抑制機(jī)制。

綜上所述，本研究以精氨酸酶為靶點(diǎn)，利用分子對(duì)接技術(shù)從唐古紅景天活性部位的11個(gè)化學(xué)成分中虛擬篩選出結(jié)合能最低的沒(méi)食子酸，并確定了沒(méi)食子酸對(duì)精氨酸酶的IC50及混合競(jìng)爭(zhēng)性的抑制機(jī)制。