關(guān) 璐，劉川川，張瑞霞*

(1.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

目前學(xué)者們多關(guān)注平原狀態(tài)下的骨骼肌的糖代謝，對(duì)高原脂代謝的研究并不多見(jiàn)且研究結(jié)論不一。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)高原低氧低溫條件下骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂代謝關(guān)鍵酶HSL和CPT1A及棕色脂肪線粒體內(nèi)產(chǎn)熱基因UCP1的表達(dá)水平的研究，觀察低氧低溫對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞脂代謝關(guān)鍵酶及解耦聯(lián)蛋白1的影響。

1.材料與方法

1.1 材料及動(dòng)物

胰蛋白酶、DMEM、離心管購(gòu)于西格瑪生物公司；SABC免疫組化染色試劑盒購(gòu)于博士德生物公司；油紅O染色試劑盒購(gòu)于索萊寶公司。RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)于天根生物公司；抗體購(gòu)于愛(ài)博泰克公司。

大鼠購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重約140～160g，動(dòng)物合格證號(hào)：20180004012817。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法

腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(0.2mL/100g)，麻醉后脫頸處死大鼠，浸泡于含75%酒精的容器內(nèi)，充分消毒后于超凈工作臺(tái)分離骨骼肌。取1 cm3腓腸肌剪碎至1 mm3，用PBS洗滌后離心，去除上清后加2 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶消化(37.0℃，20min)，期間吹打混勻，重懸細(xì)胞并接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞約2 h貼壁，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 骨骼肌細(xì)胞的鑒定方法

1.2.3 細(xì)胞分組方法

隨機(jī)分為對(duì)照組(nature group，N。氧濃度：21%。37℃)、低氧組(hypoxia group，HO。氧濃度：1%。37℃)、低溫組(hypothermia group，HT。氧濃度：21%。28℃)、低氧低溫組(hypoxia and hypothermia group，HOHT。氧濃度：1%。28℃)。

1.2.4 RNA分離、逆轉(zhuǎn)錄PCR和RT-qPCR方法

用TRIZOL法分離和提取細(xì)胞總RNA，在分光光度計(jì)上測(cè)定總RNA的濃度和純度，在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行RNA電泳，通過(guò)觀察28S RNA及18S RNA以評(píng)估RNA的完整性。根據(jù)說(shuō)明將800 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。特異性擴(kuò)增引物(表1)由上海生工生物公司合成。配制20 μL的RT-qPCR反應(yīng)液：2×SuperReal Color PreMix 10 μL，正、反向引物各0.6 μL，cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL。在ABI Q5序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行兩步法擴(kuò)增：預(yù)變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，10 s；退火及延伸60 ℃，32 s。共40個(gè)循環(huán)，以2-△△CT法對(duì)mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 RPS18與目的基因的特異性引物序列

1.2.5 Western-Blot方法

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 骨骼肌細(xì)胞形態(tài)

以酶消化法分離骨骼肌細(xì)胞，圖為已貼壁的梭形骨骼肌細(xì)胞(圖1)。

圖1 骨骼肌細(xì)胞鏡下圖(20×)

2.2 骨骼肌細(xì)胞的鑒定結(jié)果

以SABC免疫組化法鑒定骨骼肌細(xì)胞(ACTA1蛋白在骨骼肌細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá))(圖2)。

圖2 免疫組化法測(cè)定ACTA1蛋白圖

2.3 HSL、CPT1A、UCP1 mRNA表達(dá)差異

為研究低氧低溫對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，采用RT-qPCR法檢測(cè)HSL、CPT1A、UCP1 mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組、低氧組、低溫組比，低氧低溫組HSL mRNA表達(dá)增多(P<0.05)。與低溫組比，低氧低溫組CPT1A mRNA表達(dá)減少(P<0.05)。與對(duì)照組和低氧組比，低氧低溫組UCP1 mRNA表達(dá)增多(P<0.05)。

表2 各組目的基因mRNA表達(dá)水平

2.4 HSL、CPT1A、UCP1蛋白表達(dá)差異

為進(jìn)一步詳細(xì)研究低氧低溫對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，采用Western-Blot法檢測(cè)HSL、CPT1A、UCP1蛋白表達(dá)水平(圖3)。與前三組比，低氧低溫組HSL蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與對(duì)照組、低氧組比，低氧低溫組CPT1A表達(dá)水平降低(P<0.05)，與低溫組比，表達(dá)水平升高(P<0.05)。與對(duì)照組比，三組UCP1蛋白表達(dá)均減少(P<0.05)(表3)。

圖3 Western-Blot法檢測(cè)各目的蛋白表達(dá)水平圖

表3 各組目的蛋白表達(dá)水平

3.討論

對(duì)急進(jìn)高原人群來(lái)說(shuō)，機(jī)體能量代謝不同于平原地區(qū)。在這個(gè)過(guò)程中糖利用率降低，脂肪利用率升高，血液中游離脂肪酸和甘油含量增多，提示高原習(xí)服過(guò)程中脂肪分解占優(yōu)勢(shì)[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)人群棕色脂肪組織多于漢族人群[2]。高原地區(qū)糖脂代謝是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，骨骼肌的能量代謝逐漸被關(guān)注。低氧低溫條件下骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂代謝關(guān)鍵酶的改變情況未知。我們通過(guò)在低氧低溫環(huán)境下培養(yǎng)骨骼細(xì)胞，檢測(cè)脂代謝關(guān)鍵酶HSL、CPT1A及UCP1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)低氧低溫雙重因素對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂代謝水平有一定的影響，低氧低溫促進(jìn)脂代謝關(guān)鍵酶HSL mRNA及蛋白表達(dá)，抑制CPT1A mRNA及蛋白表達(dá)，低氧低溫促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞UCP1 mRNA表達(dá)，抑制骨骼肌細(xì)胞UCP1蛋白表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)，低氧低溫雙重因素促進(jìn)HSL mRNA及蛋白表達(dá)。HSL的C端有一個(gè)含200個(gè)氨基酸的調(diào)節(jié)區(qū)[3]，該區(qū)是PKA的主要靶點(diǎn)。缺氧時(shí)cAMP/PKA信號(hào)通路被激活，進(jìn)而激活HSL，使其表達(dá)升高[4]。低氧間接激活糖酵解途徑產(chǎn)生大量的丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入線粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生大量ATP，為脂肪分解供能，促進(jìn)HSL合成，這與我們的研究一致。低溫環(huán)境還可直接刺激脂肪分解，誘導(dǎo)HSL產(chǎn)生，加速脂肪動(dòng)員，使甘油三酯分解為甘油與游離脂肪酸[5]，從而促進(jìn)脂肪酸β氧化而產(chǎn)生ATP，刺激了骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。寒冷條件下促進(jìn)HSL磷酸化，其磷酸化水平越高，脂肪分解速率越高[6]，被激活的HSL水解甘油三脂的酯鍵產(chǎn)生游離脂肪酸，而游離脂肪酸是激活棕色脂肪組織內(nèi)UCP1的燃料[6，7]。對(duì)于哺乳動(dòng)物，缺氧及低溫均可激活cAMP/PKA/HSL途徑，促進(jìn)HSL的合成及活化以增加能量消耗，這也是維持體重、避免肥胖的原因[7]。

與低溫組比，低氧低溫組CPT1A mRNA表達(dá)減少，提示骨骼肌細(xì)胞內(nèi)CPT1A的減少主要受低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的誘導(dǎo)。而低溫組CPT1A表達(dá)減少的原因可能是，基因到蛋白水平存在著復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后修飾及翻譯等過(guò)程，CPT1A合成減少可緩解線粒體因脂質(zhì)過(guò)多導(dǎo)致的損傷和氧化應(yīng)激[8，9]。低氧環(huán)境促進(jìn)CPT1A的表達(dá)，在肝細(xì)胞內(nèi)，CPT1A的轉(zhuǎn)錄上調(diào)利于線粒體內(nèi)脂肪酸的攝取及氧化[8，10]，研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境促進(jìn)哺乳動(dòng)物體內(nèi)HIF的合成，HIF通過(guò)誘導(dǎo)CPT1A啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄沉默而抑制CPT1A的產(chǎn)生[11]，從而減少脂肪酸向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，使得脂肪酸以脂滴的形式儲(chǔ)存，利于高海拔地區(qū)人群御冷[12]。骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的變化也是如此，與低溫組比，低氧低溫組CPT1A mRNA合成減少，推測(cè)這種情況下細(xì)胞內(nèi)糖酵解占主要地位，糖酵解過(guò)程的加強(qiáng)促進(jìn)乳酸合成，導(dǎo)致ATP生成減少、 CPT1A合成抑制，使脂肪酸的β氧化被進(jìn)一步抑制。在蛋白水平，與對(duì)照組比，低氧低溫組CPT1A合成明顯減少，提示低氧低溫雙重因素會(huì)抑制CPT1A合成。低溫促進(jìn)CPT1A mRNA合成，而敲除CPT1A基因后，脂質(zhì)積累面積增大[11]。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為冷暴露誘導(dǎo)棕色脂肪中UCP1 mRNA的合成[13]，與我們的結(jié)果一致。而與低氧組比，低氧低溫組UCP1 mRNA合成減少，提示低溫環(huán)境抑制UCP1合成，這可能是由于UCP1是棕色脂肪組織特異基因，在骨骼肌內(nèi)該基因的表達(dá)不一定增多，也可能是低溫可激活HIF通路使CPT1A沉默，影響了脂肪酸氧化而抑制線粒體內(nèi)UCP1的表達(dá)[11]。低氧促進(jìn)AMPK的表達(dá)[14]，AMPK/PGC-1α信號(hào)通路也參與調(diào)控骨骼肌脂肪酸氧化代謝，PGC-1α與PPARα、PPARγ、ERRα等結(jié)合促進(jìn)UCP1的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪分解[15]，這與Du W等[11]的研究不一致，即低氧時(shí)HIF通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制物的產(chǎn)生而抑制PGC-1α的合成，PGC-1α進(jìn)一步抑制UCP1的合成，這是實(shí)驗(yàn)組UCP1蛋白表達(dá)減少的原因。

綜上所述，低氧低溫對(duì)骨骼肌細(xì)胞的脂代謝水平有一定的影響，低氧低溫促進(jìn)脂代謝關(guān)鍵酶HSL mRNA及蛋白表達(dá)，抑制CPT1A mRNA及蛋白表達(dá)，低氧低溫促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞UCP1 mRNA表達(dá)，抑制骨骼肌細(xì)胞UCP1蛋白表達(dá)，這可能是高海拔地區(qū)肥胖患病率、非酒精性脂肪肝患病率低于平原的原因[16]。