糞菌移植通過調(diào)節(jié)TLR4/ NF-κB信號通路改善內(nèi)毒素性急性肺損傷①

汪玉磊 譚乂珉 李 波 尹國芳 范賢明

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，炎癥與變態(tài)反應(yīng)實驗室，瀘州 646000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是肺組織彌漫性炎癥反應(yīng)，其中感染，尤其是革蘭氏陰性菌細胞的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的膿毒血癥在ALI誘因中最為常見［1-2］。目前針對ALI雖然有很多治療藥物及方法，但尋找新的、有效的治療方法仍然是ALI的研究熱點。近年來多項研究已經(jīng)證實腸肺軸的存在、腸道微生物群落與肺的各種疾?。ㄈ缦?、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化、感染等）的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而肺部疾病也會導(dǎo)致腸道微生物群落改變，影響腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能改變［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)腸缺血可通過TLR4/NF-κB 引發(fā)肺毛細血管膜損傷，導(dǎo)致ALI［5］。Toll 樣受體4（TLR4）是一種跨膜受體，在啟動免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用［6-7］。在ALI 早期受到LPS 刺激后就產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，LPS 與TLR4 受體結(jié)合經(jīng)過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），促進炎癥細胞因子的表達和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的失控誘導(dǎo)ALI［8-9］。先前的研究發(fā)現(xiàn)糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）可以改善LPS 誘導(dǎo)的ALI［10-11］，但其潛在機制仍然未知。本文通過腹腔注射LPS建立大鼠內(nèi)毒素性ALI 模型，探究糞菌移植對TLR4/NF-κB 信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 LPS 購自美國Sigma 公司；IL-10 ELISA試劑盒購自上海科興商貿(mào)有限公司；兔源性的GAPDH、MyD88、TLR4 均購自英國Abcam 公司；兔源性的NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65 購自美國Cell Signaling Technology；而HRP 標(biāo)記山羊抗兔的二抗、BCA 試劑盒及兔二抗均購自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；交由上海生物工程有限公司完成腸道菌群的高通道測序。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及創(chuàng)建模型 西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購入15只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機均分為3 組，分別為正常對照組（NS 組）、模型組（LPS 組）、干預(yù)組（FMT 組）。通過向LPS 組及FMT組腹腔內(nèi)注射LPS（5 mg/kg）構(gòu)建ALI 動物模型，NS組則注射等量無菌生理鹽水。FMT 組經(jīng)腹腔注射LPS 處理24 h 后進行糞菌移植處理（參照SUN 等［12］的制備方法提取糞菌液：收集健康對照大鼠新鮮的糞便沉淀物，將糞菌浸入無菌生理鹽水中振蕩15 min，6 000 r/min 離心15 min，去掉上清液，獲得沉淀物并再次重復(fù)以上步驟2 次，最終得到的沉淀物與氯化鈉溶液混合得到糞菌液）。采用管飼法給予FMT 組糞菌液灌胃（劑量為10 ml/kg，2 次/d，連續(xù)2 d）；NS 組和LPS 組則采用等量的氯化鈉溶液。于干預(yù)結(jié)束24 h 后處死各組大鼠，收集大鼠標(biāo)本用于后期檢測。

1.2.2 血氣分析 取大鼠的腹主動脈血在血氣分析儀上行動脈血氧分壓（PaO2）檢測。

1.2.3 血清中炎癥細胞因子的測定（ELISA 分析）抽取大鼠動脈血，靜置1 h 后在離心機中高速離心（6 000 r/min 離心5 min）提取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-10的OD值。

1.2.4 組織病理學(xué)評價及免疫組化 取左肺組織，用多聚甲醛溶液固定，然后脫水并包埋在石蠟中，將石蠟包埋的組織切塊，用蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理損害，參照SU 等［13］評分方法，根據(jù)肺泡水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡間壁增寬等指標(biāo)進行肺損傷評分。按照損傷程度評0～4分（無損傷為0分、輕微為1分、中度為2 分、重度為3 分、極重度為4 分），各項評分之和為肺組織病理評分。

為了進行免疫組織化學(xué)評估，將石蠟切片進行脫蠟和水化，抗原修復(fù)，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色復(fù)染，封片。在顯微鏡下觀察切片染色情況。免疫組化定量分析：在每張切片中任意選擇3 個區(qū)域，檢測每個視野陽性信號的灰度值。

1.2.5 肺濕/干重比（W/D）取3組大鼠新鮮右肺組織，首先稱量得到肺濕重（W），然后將肺組織放置在70℃烤箱中烘烤72 h 至脫水后稱重得到干重值（D），最后計算肺濕/干重（W/D）比值。

1.2.6 肺組織蛋白的收集及蛋白質(zhì)印跡分析 取肺組織提取蛋白，并于BCA 試劑盒測定樣品蛋白濃度，確定上樣量后行SDS 聚丙烯酰胺電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜，封閉后將膜與TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65 的一抗孵育過夜，次日與二抗孵育，經(jīng)洗膜后于暗室中曝光，將膠片進行存檔，并進行半定量分析處理。

1.2.7 腸道菌群測序 收集大鼠糞便放入凍存管進行存放，提取糞便樣品的總DNA，并檢測DNA 樣品純度及濃度。然后使用通用引物對細菌16S rDNA V3～V4區(qū)進行PCR 擴增。最后采用MiSeq測序軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本實驗結(jié)果采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)以表示，首先采用正態(tài)檢驗和方差分析對各數(shù)據(jù)檢驗，各組間結(jié)果兩兩比較時，采用配對設(shè)計資料的Student'st檢驗，多組間數(shù)據(jù)分析時采用單因素的方差分析，當(dāng)方差不齊時采用秩和檢驗（Kruskal-Wails）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠氧分壓 與NS 組相比，LPS 組PaO2明顯降低（P＜0.05），而FMT 組PaO2較LPS 組明顯上升（P＜0.05），見表1。

2.2 大鼠肺W/D 與NS 組比較，LPS 組大鼠肺W/D 顯著升高，與LPS 組比較，F(xiàn)MT 組大鼠肺W/D顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.3 大鼠組織病理變化

2.3.1 肺組織的病理觀察 LPS 組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)雜亂無章，肺泡間隔增寬，肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞；FMT 組大鼠肺泡中炎癥細胞減少，肺泡壁變薄，肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕（圖1）。

圖1 大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissues of rats（HE，×200）

2.3.2 肺組織的病理評分 與NS 組相比，LPS 組肺組織病理評分明顯增高，而FMT 組肺組織病理評分較LPS組明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠氧分壓、W/ D及肺組織病理損傷評分結(jié)果（）Tab.1 Lung tissue oxygen partial pressure，W/ D and lung tissue pathological injury score of each group（）

表1 大鼠氧分壓、W/ D及肺組織病理損傷評分結(jié)果（）Tab.1 Lung tissue oxygen partial pressure，W/ D and lung tissue pathological injury score of each group（）

Note：PaO2.Partial pressure of arterial blood oxygen；LPS.Lipopolysaccharide；FMT.Fecal fungus transplantation.Compared with NS group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05.

2.4 大鼠血清IL-10 水平 與NS 組比較，LPS 組大鼠外周血清中抑炎因子IL-10 濃度下降（P＜0.05）；與LPS組比較，F(xiàn)MT組大鼠血清抑炎因子IL-10的濃度上升（P＜0.05），見表2。

2.5 大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路的結(jié)果

2.5.1 免疫組化檢測MyD88 的變化 LPS 組肺泡上皮細胞MyD88 蛋白相對表達量顯著高于對照組，F(xiàn)MT 組肺泡上皮細胞MyD88 表達陽性率顯著低于LPS 組（P＜0.05），F(xiàn)MT 組和NS 組結(jié)果比較具有差異，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖2、表2。

圖2 大鼠肺組織MyD88蛋白表達的免疫組化結(jié)果（×400）Fig.2 Immunohistochemical results of MyD88 protein expression in rat lung tissue（×400）

表2 大鼠血清IL-10含量及肺組織MyD88表達的情況（）Tab.2 Serum IL-10 content and MyD88 expression in lung tissue of rats（）

表2 大鼠血清IL-10含量及肺組織MyD88表達的情況（）Tab.2 Serum IL-10 content and MyD88 expression in lung tissue of rats（）

2.5.2 糞菌移植對TLR4/NF-κB 蛋白通路表達的影響 與NS 組比較，LPS 組大鼠肺組織中TLR4、p-NF-κB p65 表達水平顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，F(xiàn)MT 組TLR4、p-NF-κB p65 表達水平降低（P＜0.05），見圖3。各組NF-κB p65 總的表達量無明顯變化。

圖3 大鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路表達Fig.3 Expression of TLR4/NF-κB signaling pathway in rats lung tissue

2.6 各組大鼠腸道微生物的變化 基于α 和β 多樣性指標(biāo)對各組大鼠微生物菌群進行了分析：Chao與Ace 指數(shù)表示菌群的豐富度，其數(shù)值越大證明菌群擁有更高的豐富度，NS組和FMT組的腸道菌群的豐富度高于LPS 組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4，P＞0.05）。本次各樣本的測序覆蓋率大于0.99，反映了各樣品中未被檢出的序列概率很低，表明其值可以真實反映樣本中微生物的含量。

圖4 各組大鼠腸道菌群Alpha結(jié)果分析Fig.4 Analysis of Alpha diversity of intestinal flora of rats in each group

Shannon 稀釋曲線（rarefaction curve）可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度。圖5可看出LPS組腸道菌群的豐度小于NS組和FMT組。同時也說明樣本數(shù)據(jù)量含量的合理性。

圖5 各組大鼠Shannon指數(shù)稀疏曲線圖Fig.5 Shannon rarefaction curve of rats in each group

主坐標(biāo)分析（principalco-ordinates analysis，PCoA）各組樣品之間的距離越接近則其菌落組成結(jié)構(gòu)就越相似。PCoA 分析結(jié)果顯示，LPS 組的離散程度最大，而經(jīng)糞菌移植后的FMT 組和NS 組距離接近，表示FMT組的物種結(jié)構(gòu)和NS組相似（圖6）。

圖6 主坐標(biāo)分析Fig.6 Principal coordinate analysis

3 討論

ALI 是一種常見的臨床疾病，會導(dǎo)致肺泡毛細血管膜損傷，廣泛的中性粒細胞浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放［14］。越來越多的研究表明腸道中的微生物群落對機體免疫功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要［15-16］。本研究通過大鼠腹腔注射LPS來復(fù)制急性損傷的模型。經(jīng)腹腔注射LPS 的大鼠，肺組織出現(xiàn)肺泡間隙水腫及炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺W/D明顯增加，PaO2下降，腸道菌群多樣性及豐富度下降；經(jīng)FMT 后的大鼠腸道菌群的多樣性及豐富度增加，菌群結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，同時其肺組織學(xué)、水腫程度、PaO2均得到了明顯改善。以上證據(jù)表明LPS造成了大鼠的急性肺損傷及腸道微生物結(jié)構(gòu)改變。FMT 可以在一定程度上糾正失調(diào)的腸道菌群，并對LPS 的急性肺損傷具有一定的保護作用。

TLR4被認(rèn)為是哺乳動物L(fēng)PS 的信號受體，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，NF-κB 通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起著核心作用［8］。NF-κB 信號通路激活后促進炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β 等）過度釋放，抗炎因子（IL-10）分泌不足，促炎因子和抗炎因子的失衡是造成ALI 的關(guān)鍵［7］。抗炎治療是對抗ALI 的主要治療方法，因此，尋求有效的抗炎藥物來治療ALI是目前的研究熱點［9］。IL-10 是一種多功能的細胞因子，參與機體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子，其可以調(diào)節(jié)炎癥的嚴(yán)重程度，保護正常組織免受炎癥損傷，在機體對抗感染的過程中發(fā)揮重要的保護作用［17］。其主要生物活性表現(xiàn)為可抑制單核巨噬細胞、中性粒細胞釋放多種細胞因子，減少使白細胞聚集的炎癥因子和黏附分子的產(chǎn)生，最終阻止炎癥細胞活化并遷移到炎癥部位［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)IL-10 可改善肺部炎癥并降低肺損傷的嚴(yán)重程度［20-21］。

本研究探討LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠中TLR4/MyD88/NF-κB 信號蛋白的表達。LPS 處理后，腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，肺組織中TLR4 和MyD88 蛋白的表達顯著增加，磷酸化的NF-κB p65也被上調(diào)，血清中抗炎因子IL-10 分泌明顯減少，因此TLR4 對LPS 的識別觸發(fā)了MyD88 依賴性信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)NF-κB 磷酸化，促進下游炎癥因子大量釋放，抑制抗炎因子分泌，炎癥反應(yīng)失衡導(dǎo)致ALI的發(fā)生發(fā)展，這與先前的研究結(jié)果類似［17，22］。但是經(jīng)FMT后，大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)改善，肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB p65 的表達下調(diào)，促進抗炎因子IL-10 分泌，并發(fā)揮其抗炎作用。本團隊已證實FMT后的ALI大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 分泌明顯減少［11］。本研究結(jié)果表明腸道微生物可能通過下調(diào)TLR4/MyD88 信號傳導(dǎo)有效抑制NF-κB p65 的活化，促進抗炎因子IL-10 的分泌，從而抑制白細胞的聚集，減少TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的產(chǎn)生，保護肺組織免受炎癥侵害［21］。

綜上所述，本研究在動物模型中證明了FMT 對LPS 誘導(dǎo)的ALI 的保護作用，并表明該過程可能與抗炎因子的增加相關(guān)。其機制可能是腸道微生物的代謝產(chǎn)物抑制TLR4/MyD88 途徑，抑制NF-κB 磷酸化，促進細胞因子IL-10 的分泌增加，發(fā)揮其抗炎作用。