陳思勤 曾普華 張 振 馬思靜 袁 坤 何鳳姣

（湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，長沙 410006）

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的首要原因，我國肺癌發(fā)病率和病死率也呈持續(xù)上升趨勢［1］。盡管肺癌治療手段不斷改進，但晚期轉(zhuǎn)移仍是預(yù)后不良的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的主要病理機制，但誘導(dǎo)EMT 起始及進展的調(diào)控機制尚未明確［2-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是腫瘤細胞間信息交流的重要途徑，通過自分泌包裹microRNA（miRNA）等活性成分的外泌體可促進EMT 發(fā)生，增強腫瘤細胞遷移和侵襲能力［4-5］。固肺消積飲是我科治療肺癌常用方劑，已在臨床研究中證實具有緩解癥狀、增強化療效果、降低副作用等功效，但其作用機制仍無相關(guān)報道［6-8］。本文擬從外泌體角度探討固肺消積飲對肺癌A549細胞的作用機制，并結(jié)合文獻報道和前期預(yù)實驗結(jié)果選取1個外泌體中差異性表達miRNA，即microRNA-186-5p（miR-186-5p），深入研究外泌體中的活性成分［9-11］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雌性Wistar 大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重180～220 g。

1.1.2 主要試劑與儀器 肺癌A549 細胞（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清（美國SBI 公司）；RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司）；LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑、Total Exosome Isolation 試劑盒（美國Invitrogen公司）；BCA蛋白定量試劑盒、DAPI、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit（美國Sigma 公司）；Phalloidin（美國Life Technologies 公司）；CD63、TSG101、Calnexin、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH一抗（英國Abcam公司）；Transwell小室（美國Corning 公司）；Matrigel 基質(zhì)膠（美國BD Bioscience公司）；JEM-1400透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將肺癌A549細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%無外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)。將miR-186-5p NC、miR-186-5p inhibitor（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成）轉(zhuǎn)染至A549 細胞，按照LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。

1.2.2 固肺消積飲含藥血清制備 40只Wistar大鼠灌胃給予固肺消積飲（本院中藥房提供，20 g/kg），2 次/d，連續(xù)7 d，第7 天第1 次灌胃后2 h 行腹主動脈采血，無菌條件下分離血清，4℃、100 000 r/min離心70 min，取上清，去除外泌體沉淀，56℃滅活30 min，0.22 μm 濾器過濾除菌，-70℃保存?zhèn)溆?，即獲得固肺消積飲含藥血清［12］。采用等體積生理鹽水灌胃作為對照，獲得無藥血清。

1.2.3 外泌體分離與收集 無藥血清（10%）誘導(dǎo)A549細胞48 h，取上清，獲得的外泌體記為NC-Exo。固肺消積飲含藥血清（10%）誘導(dǎo)A549 細胞48 h，取上清，分離的外泌體記為XJD-Exo。固肺消積飲含藥血清（10%）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-186-5p NC的A549細胞48 h，取上清，分離的外泌體記為XJD-miR-186-5p NC-Exo。固肺消積飲含藥血清（10%）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染miR-186-5p inhibitor的A549細胞48 h，取上清，分離的外泌體記為XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo。按照Total Exosome Isolation 試劑盒說明書進行外泌體抽提：收集上清，5 000 r/min 離心20 min，收集上層無細胞碎片的上清，加入1/2體積的外泌體提取試劑，混勻，4℃孵育過夜，次日4℃、12 000 r/min 離心60 min，棄上清，加入適量PBS 重懸外泌體沉淀，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。

1.2.4 外泌體鑒定

1.2.4.1 透射電鏡觀察外泌體形態(tài) 取20 μl外泌體懸液至2 mm 載樣銅網(wǎng)，室溫靜置5 min，濾紙吸干多余液體，滴加20 μl 3%磷鎢酸，室溫復(fù)染5 min，濾紙吸干多余液體，65℃白鎢燈烘烤15 min，120 kV JEM-1400透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照。

1.2.4.2 Western blot 檢 測CD63、TSG101 和Calnexin 表達 取20 μg外泌體懸液，常規(guī)進行Western blot 實驗，一抗孵育濃度分別為：CD63（1∶500）、TSG101（1∶1 000）、Calnexin（1∶1 000）。

1.2.5 熒光標記法檢測A549 細胞攝取外泌體情況 將A549細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿，貼壁后加入PKH67 標記的外泌體（2 μg），采用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit 進行標記，常規(guī)培養(yǎng)48 h，PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌，1%Triton 透化10 min，PBS 洗滌，1%牛血清白蛋白封閉30 min，PBS 洗滌，DAPI 避光染色6 min，PBS 洗滌，Phalloidin 避光染色30 min，PBS 洗滌，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 RT-qPCR 檢測外泌體中miR-186-5p 表達引物序列：miR-186-5p F：5'-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACT-3'，R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2.7 實驗分組 實驗分為：A 組（A549 細胞+PBS）、B 組（A549 細胞+NC-Exo）、C 組（A549 細胞+XJD-Exo）、D 組（A549 細胞+XJD-miR-186-5p NCExo）、E 組（A549 細胞+XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo）。將A549 細胞接種于6 孔板，隨機分為5 組，B、C、D、E 組分別取上述4 種外泌體（100 μg/ml）與A549細胞共培養(yǎng)48 h，A組加等體積PBS作為對照。

1.2.8 Transwell 實驗檢測各組細胞遷移和侵襲遷移實驗：共培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次，胰酶消化獲得細胞，不含血清的1640培養(yǎng)基重懸細胞，將含有6×104個細胞的200 μl懸液加入Transwell上室，下室加入600 μl 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，光學顯微鏡下拍照并計算細胞數(shù)。侵襲實驗：Transwell 上室底部鋪20 μl Matrigel 基質(zhì)膠，其余步驟參照遷移實驗。

1.2.9 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達 共培養(yǎng)48 h，收集A549細胞，加入RIPA 裂解液充分裂解細胞，離心，取上清，BCA 蛋白定量。取40 μg 總蛋白，常規(guī)進行Western blot 實驗，一抗孵育濃度分別為：E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0 或Graphpad prism 6.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定 透射電鏡下觀察到外泌體呈典型圓形或橢圓形囊泡狀，分散或聚集性分布。Western blot 結(jié)果顯示，與A549 細胞相比，外泌體高表達表面分子標志物CD63 和TSG101，低表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志蛋白Calnexin（圖1）。

圖1 外泌體鑒定Fig.1 Identification of exosomes

2.2 外泌體攝取 PKH67 標記的外泌體與A549細胞共培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察到標記為綠色熒光的外泌體主要分布于A549細胞胞漿內(nèi)（圖2）。

圖2 熒光標記法檢測A549細胞攝取外泌體情況（×400）Fig.2 Uptake of exosomes by A549 cells detected by fluorescence labeling（×400）

2.3 外泌體中miR-186-5p 表達 共分離得到4 種外泌體，即NC-Exo、XJD-Exo、XJD-miR-186-5p NCExo、XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo，qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，各外泌體中miR-186-5p 表達水平分別為（1.00±0.14）、（4.69±0.53）、（4.52±0.64）、（0.87±0.31），差異有統(tǒng)計學意義（F=267.800，P＜0.001，n=12）。NC-Exo、XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo 中miR-186-5p表達水平低于XJD-Exo、XJD-miR-186-5p NC-Exo，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組細胞遷移和侵襲能力 Transwell 結(jié)果顯示，各組間遷移和侵襲能力差異均有統(tǒng)計學意義（F=171.200，P＜0.001；F=168.300，P＜0.001）。A、C、D組遷移、侵襲能力低于B、E 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Transwell檢測各組細胞遷移和侵襲（×100）Fig.3 Transwell test to detect cell migration and invasion（×100）

2.5 各組細胞EMT相關(guān)蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，各組間E-cadherin、N-cadherin、vimentin 表達差異均有統(tǒng)計學差異（F=35.470，P＜0.001；F=149.100，P＜0.001；F=413.300，P＜0.001）。A、C、D組E-cadherin 表達高于B、E 組，N-cadherin、vimentin 表達低于B、E組，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達Fig.4 Expressions of EMT related proteins detected by Western blot

3 討論

與放化療等現(xiàn)代醫(yī)學手段相比，中醫(yī)藥具有毒副作用小、耐藥性低、生活質(zhì)量好等優(yōu)勢，且多活性組分配伍復(fù)方可能通過多種作用靶點發(fā)揮更好的治療效應(yīng)，因此近年中醫(yī)藥在腫瘤治療中逐漸得到重視。我院蔣益蘭教授提出肺癌轉(zhuǎn)移原因可能在于“虛、瘀、痰、毒”，并基于該理論基礎(chǔ)將固肺消積飲作為我科治療肺癌的基本方劑。固肺消積飲由益氣化瘀解毒方發(fā)展而來，包含人參、補骨脂、黃芪、莪術(shù)等多種中草藥，具有清熱解毒、益氣祛痰、化瘀散結(jié)等功效，在臨床應(yīng)用中獲得了較好療效。賀佐梅等［6］通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選、基因富集分析等網(wǎng)絡(luò)藥理學分析方法發(fā)現(xiàn)，固肺消積飲可能參與調(diào)控PI3K/AKT 及鈣離子信號通路。但關(guān)于固肺消積飲治療機制卻鮮有報道，理論研究嚴重滯后，本文旨在進一步探討其治療機制。

外泌體是一種脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形或橢圓形微小囊泡，直徑約30～100 nm，可由大多數(shù)細胞通過內(nèi)吞、融合、外排等一系列復(fù)雜過程主動向外分泌，用于細胞間信息傳遞與物質(zhì)運輸［13-14］。大量研究表明，異常的細胞間通訊是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，外泌體則起關(guān)鍵信使作用，該效應(yīng)不僅存在于腫瘤實質(zhì)細胞與免疫細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等支持細胞間，還大量存在于癌細胞間，甚至通過自分泌進行自我調(diào)節(jié)［15］。近年外泌體途徑成為藥物研發(fā)的熱門靶點，也為探索已有藥物的治療機制提供了方向［16］。因此，本研究擬通過外泌體途徑尋找固肺消積飲抑制肺癌轉(zhuǎn)移的突破口。

通過分離肺癌A549 細胞外泌體（NC-Exo）與A549 細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，與A 組相比較，B 組遷移、侵襲能力及EMT 轉(zhuǎn)化程度顯著提高，表明A549細胞來源外泌體可促進細胞遷移和侵襲，證實外泌體自分泌途徑在肺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。為進一步探討固肺消積飲能否通過外泌體途徑發(fā)揮治療效應(yīng)，課題組制備固肺消積飲含藥血清用于誘導(dǎo)A549 細胞獲得XJD-Exo，共培養(yǎng)后結(jié)果顯示，C 組遷移、侵襲能力及EMT 轉(zhuǎn)化程度均顯著低于B 組，表明固肺消積飲含藥血清可通過外泌體途徑抑制肺癌轉(zhuǎn)移，可能與固肺消積飲對外泌體某種活性成分的調(diào)控有關(guān)。

外泌體的生物學功能主要取決于其活性成分，如Rab 蛋白、GTP 酶與細胞膜融合有關(guān)［17］；膽固醇、鞘磷脂等脂質(zhì)成分可提高細胞膜穩(wěn)定性［18］；腫瘤易感基因101 蛋白（TSG101）參與外泌體形成［19］。外泌體miRNA 也在腫瘤遷移和侵襲中扮演重要角色，如LI 等［20］發(fā)現(xiàn)，來自外泌體的miR-302b 可靶向TGFβRⅡ/ERK 信號通路，從而抑制肺癌細胞增殖和遷移。為深入挖掘外泌體中的有效成分，課題組結(jié)合文獻報道和前期預(yù)實驗結(jié)果選取差異表達的miR-186-5p，即固肺消積飲含藥血清可顯著上調(diào)外泌體中miR-186-5p 水平。通過RNA 轉(zhuǎn)染技術(shù)選擇性抑制miR-186-5p 表達，進而阻斷固肺消積飲含藥血清對外泌體miR-186-5p的促表達效應(yīng)，得到XJDmiR-186-5p inhibitor-Exo。與C組相比，E組遷移、侵襲能力及EMT 轉(zhuǎn)化程度均提高，但尚未達到B 組水平，表明抑制外泌體miR-186-5p 水平可部分逆轉(zhuǎn)固肺消積飲的保護效應(yīng)，證實固肺消積飲通過上調(diào)外泌體miR-186-5p 表達的保護機制，但該途徑并不是唯一作用機制，可能還有其他途徑仍需進一步研究。

綜上所述，本研究認為固肺消積飲可通過上調(diào)外泌體miR-186-5p 表達抑制肺癌A549 細胞遷移和侵襲，但尚有多個方面未探討清楚，未來可作為主要研究方向，如固肺消積飲對miR-186-5p 的調(diào)節(jié)機制、miR-186-5p具體的靶基因等。