陶 喆，王玉鵬，黎威巍，陳舒麗，單士剛，包永芬**

(1．湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2．湖北科技學院臨床醫(yī)學院；3．湖北科技學院基礎醫(yī)學院)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中起到調節(jié)因子的作用，近年來的研究發(fā)現(xiàn)它也影響T和B細胞的功能，從而對免疫系統(tǒng)產生影響。5-HT運載蛋白對5-HT具有關鍵調控作用，并且在免疫細胞廣泛表達。5-HT運載蛋白啟動子區(qū)多態(tài)性與人的精神抑郁狀態(tài)存在關聯(lián)[1-4]。銀屑病是一種復雜性疾病，發(fā)病機制涉及遺傳、免疫、內分泌等因素。鑒于銀屑病是一種在某種程度上由自身免疫系統(tǒng)慢性調節(jié)障礙導致的炎癥性皮膚過度增生性疾病和病人一般有精神狀態(tài)抑郁的特征，本研究重點從分子水平分析銀屑病病人5-HT運載蛋白啟動子區(qū)多態(tài)性與正常人此區(qū)域的多態(tài)性，以期驗證5-HT運載蛋白啟動子區(qū)多態(tài)性與銀屑病的相關性。

1 材料與方法

1.1 入選標準

①湖北地區(qū)、漢族；②無銀屑病等自身免疫性疾病家族史；③所有參與研究的個體間無親緣關系，無任何符合診斷標準的精神疾病，既往無精神疾病及家族病史；④患者典型臨床表現(xiàn)為紅斑、鱗屑等，除此之外還包括Auspitz征等典型表現(xiàn)，病史為反復發(fā)作、遷延不愈。

1.2 一般資料

參與本研究的尋常型銀屑病患者(觀察組)均選取自2015年9月至2016年12月在湖北科技學院附屬醫(yī)院皮膚性病科和中國人民解放軍一九五醫(yī)院皮膚科就診的患者。100例中男50例，女50例；平均發(fā)病年齡(43±11)歲；漢族。

所有健康對照選取自同一時期本院職工和大學生志愿者150名，其中男75名，女75名；平均年齡(32±12)歲。同樣由參與者或其監(jiān)護人在知情同意書上簽字，經(jīng)由專業(yè)流行病調查員記載資料。

1.3 方法

1.3.1 DNA采集

含有抗凝劑(EDTA)的采血管抽取5mL靜脈血，保存于-20℃冰箱備用。提取DNA用相應的試劑盒，目的基因位點用PCR擴增，用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證相關的基因型。

1.3.2 引物設計

在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上下載5-HTTLPR的基因序列。使用primer 5.0進行引物設計:5-HTTLPR位點上游引物:5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA AC-3'，下游引物:5'-GCA GCA GAC AAC TGT GTT CAT C-3'。

1.3.3 反應體系及擴增條件

優(yōu)化的PCR反應體系如下：

體系體積10×緩沖液2μL25mmol/L MgCl21.5μL2.5mmol/L dNTP1.6μL10μmol/L 5-HTTLPR上、下游引物1.0μL5U/μL Pfu酶0.5μL100ng/μL DNA 模板1μL補充ddH2O至適當體積體系總體積20μL

優(yōu)化的PCR反應步驟:預變性(95℃)5 min；35個循環(huán)如下：94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 60s；最后72℃延伸10min。把以上PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，拍照并分析結果。

1.3.4 基因型鑒定

根據(jù)電泳結果分析個體的基因型，在2%瓊脂糖凝膠中每孔加入15μL擴增產物，電泳時所用電壓為80V，根據(jù)條帶位置終止電泳(美國BIO-RAD電泳儀)。凝膠經(jīng)核酸染料染色后，在成像儀中觀察并拍照記錄結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

整理該研究中的實驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行相關的數(shù)據(jù)分析。方法包括頻數(shù)分析、Hardy-Weinberg平衡定律(H-W定律)的吻合度檢驗、χ2檢驗等。

2 結 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗

經(jīng)統(tǒng)計分析，5-HTTLPR位點觀察組(χ2=2.393，P>0.05)，對照組(χ2=0.867，P>0.05)；5-HTTVNTR 位點觀察組(χ2=1.253，P>0.05)，對照組(χ2=0.268，P>0.05)，觀察值與期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg定律。說明樣本具有群體代表性，資料可靠。

2.2 5-HTTLPR位點多態(tài)性電泳結果

通過設計的相關引物，PCR后電泳檢測到兩個條帶：528bp(Long，L)和485bp(Short，S)，即可分為L/L、L/S和S/S 3種基因型。見圖1。

L/L基因型：1、8、11；L/S基因型：2、3、4、5、6、7、10、12；S/S基因型：9

2.3 5-HTTLPR基因型在觀察組與對照組的情況分析

3組基因型頻率在總體分布上兩組差異無統(tǒng)計學意義(χ2=4.53，P>0.05)。見表1。

表1 5-HTTLPR各等位基因及基因型頻率的分布

2.4 5-HTTLPR基因型在各組中的分布按性別分層后的比較

觀察組和對照組比較，性別基因型分布無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 5-HTTLPR 基因型按性別分層后的分布

3 討 論

5-HT又名血清素(serotonin)，主要是由嗜鉻細胞分泌的色氨酸衍生，作為一種體內非常重要的神經(jīng)遞質，其主要的生理學功能包括調控痛覺、體溫和睡眠等，其發(fā)揮作用的機制是通過與細胞膜上的相應受體結合。1984年Slauson等[5]研究表明5-HT具有調節(jié)淋巴細胞免疫抑制功能，并在免疫系統(tǒng)中也有明顯的作用。5-HT與過敏性疾病、腫瘤和精神神經(jīng)類疾病發(fā)生與治療有一定聯(lián)系，尤其是神經(jīng)精神類疾病，它作為免疫調節(jié)因子調控機體神經(jīng)免疫調節(jié)網(wǎng)絡，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)，其發(fā)揮免疫調控作用的機制可能是與免疫細胞表面存在的受體有關，5-HT通過與細胞表面的不同受體結合，發(fā)揮相應的免疫調節(jié)功能[6]。

5-HTT定位于神經(jīng)突觸前膜，能夠對存在于突觸間隙的5-HT進行再攝取，從而影響5-HT在突觸間隙的含量，由此調控中樞5-HT系統(tǒng)和外周5-HT效應，而產生相應的生物學效應。5-HT轉運體的蛋白表達受其基因多態(tài)性影響，進而導致5-HT的改變。人類5-HT轉運體由單基因編碼(SLC6A4)，該基因定位于17q11.1～17q12區(qū)，由14個外顯子構成編碼序列，與5-HT轉運體相關的基因多態(tài)性區(qū)有3個，其中研究最多的是5-HTTLPR。位于轉錄啟始位點上游的1kb處，包括2種等位基因，兩者相差44個堿基對，插入或缺失形成L型(長)和S型(短)，由此在不同的個體中可能會出現(xiàn)三種基因型:LL型(純合子插入)，LS型(雜合子插入/缺失)，SS(純合子缺失)[7]。不同的基因型會影響5-HT轉運體基因mRNA水平和蛋白表達能力，L等位基因比S等位基因的基礎轉錄效率要高一些，從而引起重攝取5-HT的活力提高。在淋巴母細胞中，Hranilovic等[8]研究發(fā)現(xiàn)LL基因型細胞表達5-HT轉運體mRNA水平比含S等位基因的細胞提高約30%左右，同樣的研究被Heils等[7]證實：LL基因型含5-HT轉運體數(shù)量比LS或SS基因型多30%～40%，并且重攝取5-HT的量是LS或SS基因型的2倍左右[9]。由此可以推斷有些疾病的發(fā)生發(fā)展可能和該基因的基因型有關聯(lián)，但是我們通過研究發(fā)現(xiàn)5-HTTLPR三種基因型在觀察組分布上與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，同M?ssner的研究一致[10]，同時我們還進行了性別分層后的比較，研究發(fā)現(xiàn)男、女銀屑病組和正常組比較，基因型分布無明顯差異(P>0.05)。這些研究表明5-HTTLPR的多態(tài)性與銀屑病沒有相關性，它可能通過其他的機制調控疾病的發(fā)生。

由此推斷具有不同5-HTTLPR基因型的人可能在5-HT的攝取及對阻斷5-HT攝取藥物的反應有所不同。5-HTT基因型對5-HTT表達的調控作用還影響到人類患焦慮-抑郁譜障礙的易感性及對環(huán)境應激的適應性。臨床研究表明，5-HTTLPR的2個等位基因與心境障礙、人格特征、精神分裂癥、物質依賴、廣泛性焦慮障礙等具有相關性或連鎖不平衡，但各研究結果之間有矛盾之處[11-17]。雖然本研究的5-HTT基因型與疾病沒有相關性，但是后續(xù)我們還將開展該基因其它位點的多態(tài)性與疾病的關聯(lián)，以期從遺傳學的角度闡述銀屑病的發(fā)病機制。