孫燕婷,吳 畏,吳思思,薛榮亮

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 麻醉科,陜西 西安,710004;2.陜西省寶雞高新人民醫(yī)院 麻醉科,陜西 寶雞,721013;3.陜西省寶雞中心醫(yī)院 麻醉科,陜西 寶雞,721000)

腎臟缺血再灌注損傷(IRI)是臨床上較為常見的缺血性損傷病變，腎臟是血供較為豐富的 器官，其在發(fā)生缺血或缺血再灌注時引發(fā)IRI的概率更高[1]。七氟醚(Sev)是臨床兒科全身麻醉中常用的新型吸入麻醉藥，其在誘導(dǎo)期及維持期的麻醉效果良好[2]。研究[3]證實Sev在心、肝等機(jī)體重要器官的缺血性損傷中發(fā)揮了較好的保護(hù)作用，但在腎臟IRI中的作用機(jī)制尚不明確。研究[4]表明一氧化氮(NO)在IRI中發(fā)揮重要作用，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)則是NO在腎組織中表達(dá)最高的分型。本研究采用Sev對IRI模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其腎功能及腎組織病理變化，檢測大鼠腎臟組織中eNOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)水平，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

選取45只健康的無特定病原體(SPF)級雄性大鼠[購自上海杰思捷有限公司，許可證號:SYXK(滬)2018-0004],體質(zhì)量為(221±18)g,飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔，室溫22～26 ℃,相對濕度55%～65%。采用數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠分為MB組(假手術(shù)組)、YB組(IRI模型組)、ZL組(Sev+IRI),每組15只。本研究內(nèi)容經(jīng)本院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 儀器、試劑

Sev揮發(fā)罐(湖北新鳴泰有限公司);Sev(雅培,US);免疫組化試劑盒(上海雅吉有限公司);烏拉坦(武漢卡布達(dá)有限公司),iNOS/eNOS 兔抗人多克隆抗體(杭州華安有限公司),TUNEL試劑盒(瑞士,Roche)。

1.3 動物模型制備

大鼠術(shù)前禁食8 h、禁飲4 h,采用2%戊巴比妥鈉鹽麻醉后給予呼吸器(60次/min),潮氣量為13～15 mL。MB組經(jīng)腹部開口找到左、右腎臟，腎蒂游離后縫合;YB組、ZL組采用MB組方法找到雙腎后，避開輸尿管夾閉腎動、靜脈，腎臟變暗紅色代表缺血完成,45 min后放開恢復(fù)血流供應(yīng)，腎臟恢復(fù)鮮紅色代表血流恢復(fù);ZL組建立IRI模型后，在有機(jī)玻璃麻醉箱內(nèi)，通過氣體揮發(fā)管輸入O2和Sev,測定Sev濃度維持在2.2%,持續(xù)3 h后恢復(fù)大鼠自由飲食。

1.4 血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)測定

大鼠建模成功后4、12、24 h時，多次采集眼眶全血3 mL,放置20 min(25 ℃),2 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min,收集血清于-70 ℃凍存。采用生化分析儀測定BUN、Scr水平。

1.5 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察

給予大鼠100 g/L烏拉坦注射麻醉處死后，取腎組織甲醛溶液固定、石蠟包埋后切片4 μm,然后將切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察其病理形態(tài)。

1.6 Paller法評估腎小管壞死率評分

根據(jù)Paller法對腎小管損害進(jìn)行評分(由病理專業(yè)人員采用單盲法進(jìn)行):光鏡隨機(jī)選取5個視野，每個視野選擇10個腎小管計分，其中細(xì)胞脫落壞死為1分;管型、碎片型為2分;上皮細(xì)胞顆粒變性為1分;空泡變性為1分;細(xì)胞核固縮為1分;腎小管擴(kuò)張、細(xì)胞扁平為1分。

1.7 免疫組化檢測eNOS、iNOS水平

將各組大鼠腎組織樣本脫蠟水化,H2O2失活，低火加熱1 min修復(fù)抗原并加血清封閉，加eNOS、iNOS一抗(稀釋比例1∶250),PBS沖洗，再加入二抗(山羊抗鼠IgG抗體，稀釋比例1∶500),最后加入DAB顯色劑染色。染色時，以PBS代替一抗。顯微鏡觀察結(jié)果,eNOS為每例標(biāo)本觀察5～10個小血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),iNOS為每例標(biāo)本觀察10～20個腎小球的毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，標(biāo)本制備、指標(biāo)測定由不同人員操作。判斷標(biāo)準(zhǔn)為無染色，記錄為陰性(-);染色為黃色、棕黃色，記錄為陽性(+);染色為棕褐色，記錄為強(qiáng)陽性()。

1.8 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡

腎組織進(jìn)行浸蠟、包埋、石蠟切片,2 μm厚度切片5張，而后進(jìn)行TUNEL染色，凋亡細(xì)胞的胞核染色為棕黃色，采用光學(xué)顯微鏡在單張切片的5個不重復(fù)點(diǎn)進(jìn)行觀察。凋亡率=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MB組、YB組及ZL組大鼠腎功能指標(biāo)變化

與MB組大鼠相比,YB組、ZL組大鼠4、12、24 h的BUN、Cr水平均升高，且YB組大鼠12、24 h的BUN、Cr水平均高于ZL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.2 MB組、YB組及ZL組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)比較

MB組大鼠腎臟組織細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞間距均勻。YB組大鼠腎小管有擴(kuò)張表現(xiàn)，組織排列混亂，細(xì)胞扁平且多壞死，病變處為片狀，間質(zhì)充血明顯，出現(xiàn)中粒細(xì)胞侵潤。ZL組上述病灶范圍、充血等病理均有一定改善。見圖1。

表1 MB組、YB組及ZL組大鼠腎功能指標(biāo)比較

2.3 Paller氏評分評估MB組、YB組及ZL組大鼠腎小管壞死率

YB組、ZL組大鼠4、12、24 h腎小管Paller評分均高于MB組，且YB組大鼠4、12、24 h腎小管Paller評分均高于ZL組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 MB組、YB組及ZL組大鼠腎小管壞死率

2.4 MB組、YB組及ZL組大鼠腎臟組織eNOS、iNOS比較

與MB組相比,YB組大鼠腎組織eNOS強(qiáng)陽性表達(dá)降低,iNOS強(qiáng)陽性表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與YB組相比,ZL組大鼠腎組織eNOS強(qiáng)陽性表達(dá)增強(qiáng),iNOS強(qiáng)陽性表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 MB組、YB組及ZL組大鼠腎組織eNOS、iNOS水平比較

2.5 MB組、YB組及ZL組大鼠細(xì)胞凋亡率比較

YB組、ZL組大鼠腎組織中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率高于MB組，且YB組大鼠腎組織中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率高于ZL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

3 討 論

研究[5]發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞損傷及功能喪失在腎臟IRI進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。該癥一般發(fā)生在腎移植、切除術(shù)、腎部分血管形成術(shù)、需要暫時阻斷腎臟血流的創(chuàng)傷性外科手術(shù)過程中，當(dāng)血流灌注恢復(fù)后，腎組織出現(xiàn)功能障礙、結(jié)構(gòu)損傷，從而引起腎小管壞死、腎小球堆積堵塞致使腎臟形態(tài)發(fā)生不同程度的改變，這也是造成部分患者急性腎衰竭及恢復(fù)延遲的主要原因[6]。Sev是臨床常用的刺激性較小的麻醉藥物，其能夠降低心、肺等器官術(shù)后發(fā)生IRI的概率，有研究[7]顯示Sev在減輕腎臟IRI中有良好的效果，但其作用機(jī)制尚無定論。

BUN、Cr是現(xiàn)階段臨床中普遍應(yīng)用的腎功能診斷指標(biāo)，能有效反映腎功能的損傷程度。研究[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)Sev干預(yù)后缺血再灌注大鼠腎功能顯著改善，表明Sev在緩解大鼠腎臟缺血再灌注損傷中效果確切，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)Nrf2信號通路相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,Sev干預(yù)12、24 h時，ZL組大鼠BUN、Cr水平低于YB組，提示Sev對缺血再灌注后腎損傷具有緩解作用。楊柳等[9]建立腎臟IRI小鼠模型并給予Sev干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠BUN、Cr及細(xì)胞凋亡數(shù)量較IRI小鼠明顯降低，證實Sev能夠減輕腎臟IRI大鼠的腎功能損傷，對腎臟起到保護(hù)作用。周文濤等[10]在其研究中同樣證實了Sev干預(yù)可以緩解腎臟IRI大鼠腎功能損傷。李苗等[11]通過敲除小鼠HIF-2α基因后，建立腎缺血再灌注損傷模型，給予Sev干預(yù)后結(jié)果顯示,Sev預(yù)處理可降低腎臟IRI大鼠BUN、Cr表達(dá)水平，激活HIF-2α蛋白，提示Sev對腎臟IRI具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控HIF-2α信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果表明，給予Sev干預(yù)后，ZL組腎組織病理狀態(tài)得到一定改善，且ZL組大鼠腎小管Paller評分較YB組顯著降低，說明Sev能夠減輕大鼠腎臟IRI，具有保護(hù)機(jī)制。研究[12]表明腎臟缺血再灌注的過程中，細(xì)胞凋亡與腎功能降低關(guān)系密切。本研究結(jié)果提示，在腎缺血再灌注過程中，腎小管上皮細(xì)胞凋亡加劇，而Sev干預(yù)后的腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量則明顯減少。

NO合成與NOS關(guān)系密切,eNOS分布較為廣泛，在腎小球、血管中均有表達(dá)，既往研究[13]證實NO作為血管內(nèi)皮舒張因子在免疫功能調(diào)節(jié)、腎臟血流穩(wěn)定和腎小球濾過功能以及內(nèi)皮損傷緩解方面發(fā)揮重要作用。研究[14]顯示,eNOS參與腎臟IRI的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)其表達(dá)升高時，可緩解腎臟IRI,對腎臟起保護(hù)作用;腎臟損傷時,iNOS在炎性細(xì)胞介導(dǎo)下表達(dá)升高，可引發(fā)細(xì)胞毒性反應(yīng)，間接促進(jìn)了腎損傷的發(fā)展。有學(xué)者[15]建立腎臟IRI大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠腎組織的iNOS表達(dá)明顯升高，給予不同濃度的Sev干預(yù)后，腎臟IRI大鼠iNOS的表達(dá)降低，從而減輕了腎臟缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，與YB組相比,ZL組大鼠腎組織eNOS強(qiáng)陽性表達(dá)升高,iNOS的強(qiáng)陽性表達(dá)降低，提示Sev能夠提高腎臟eNOS水平，抑制iNOS表達(dá)，進(jìn)而在腎臟缺血再灌注中發(fā)揮保護(hù)作用。聶陽等[16]給予心肌缺血再灌注損傷大鼠甘木通總黃酮干預(yù)，結(jié)果顯示，藥物干預(yù)組大鼠機(jī)體內(nèi)eNOS表達(dá)升高，且大鼠病癥有效緩解，因此推測Sev對腎臟IRI大鼠的保護(hù)作用可能與激活eNOS活性表達(dá)相關(guān)。

綜上所述,Sev干預(yù)可改善腎臟IRI大鼠的腎功能，降低腎小管壞死率，對腎臟起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)eNOS表達(dá)有關(guān)。本研究因成本、樣本量受限制、未加入陽性藥物對照組等問題，存在一定的局限性，后續(xù)應(yīng)采用更多的實驗方法為腎臟缺血再灌注損傷的治療提供可靠依據(jù)。