劉玥彤，蒙蘭青2，劉佩，楊鎏鑫，劉蕾3，歐陽揚，黃清2，陳維，陳玉珍，方子文

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；3. 廣東省粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512000)

腦卒中在中醫(yī)被稱為中風(fēng)，以突然昏仆、半身不遂、肢體麻木、舌蹇不語、口舌歪斜、偏身麻木等為主要表現(xiàn)的腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病。中藥是中華民族的瑰寶，幾千年來在腦卒中治療中積累了豐富的臨床經(jīng)驗，由于缺乏對其作用機制的科學(xué)闡釋，影響了中藥在腦卒中治療中的應(yīng)用。應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)分析和闡釋中藥在治療腦卒中的作用機制，是目前中醫(yī)藥學(xué)者研究的焦點[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和通量組織學(xué)為基礎(chǔ)的全新學(xué)科，將中藥與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，建立了一種新的研究方法——中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，解釋藥物-基因-疾病三者之間的關(guān)系[2]。分子對接是一種研究小分子配體與蛋白質(zhì)受體之間相互作用和識別的理論方法。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)相結(jié)合共同研究中藥治療腦卒中，為活性成分篩選和機制探索提供新的方法[3-4]。本文將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討中藥在治療腦卒中作用機制。

1 中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)

1.1中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) 自從英國藥理學(xué)家Hopkins于2007年提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”概念后，中醫(yī)藥研究工作者在多學(xué)科理論基礎(chǔ)上，通過可視化軟件構(gòu)建“中藥、成分、靶點、疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，評估藥物的有效性、作用機制以發(fā)現(xiàn)高效低毒的藥物[5-6]。我國學(xué)者李梢[7-8]于2002年首次提出通過生物信息學(xué)分析復(fù)雜系統(tǒng)，從“關(guān)系→網(wǎng)絡(luò)→功能”角度探討中藥對疾病的干預(yù)作用。以“網(wǎng)絡(luò)”為核心，利用公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)技術(shù)對藥物成分的靶點信息和特定疾病的靶點信息進行篩選，通過Venny等平臺進行映射取交集得到交叉靶點，即該藥治療疾病的潛在作用靶點[9]。然后構(gòu)建“藥物-基因-靶點-疾病”互作網(wǎng)絡(luò)，以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)為切入點，探討藥物對“致病網(wǎng)絡(luò)”的作用機制并對藥物 防治疾病的潛在作用靶點、參與調(diào)控的信號通路及中藥復(fù)方制劑配伍規(guī)律進行預(yù)測[10-11]。最后以實驗數(shù)據(jù)支撐，揭示中藥的現(xiàn)代藥理學(xué)機制。朱德才等[12]對丹參治療缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)潛在效應(yīng)機制進行研究，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)丹參中有效成分38種，丹參治療缺血性腦卒中的核心靶標(biāo)83個，后通過GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)丹參中的丹參素、丹參酚等化合物可通過調(diào)節(jié)卒中后側(cè)支動脈的直徑、抗血小板凝聚、抗氧化等諸多作用治療CIS。川芎嗪是中藥川芎中所含的有效成分之一，常用來治療缺血性腦卒中、冠心病等相關(guān)的多種疾病，基于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，構(gòu)建化學(xué)成分和疾病相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中包含150個作用靶點和410個與缺血性腦卒中相關(guān)的靶標(biāo)，分析提示川芎嗪可以調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)、炎癥、血小板功能、血管功能等生物過程方面及調(diào)控補體和凝血級聯(lián)、鈣信號通路、血小板活化、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等信號通路發(fā)揮活血化瘀作用[13]。

常用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫主要藥物分子數(shù)據(jù)庫、靶點數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫及通路數(shù)據(jù)庫等，見表1，基于以上數(shù)據(jù)庫可篩選藥物有效成分及網(wǎng)絡(luò)可視化分析[14-15]。

表1 常用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及特點

1.2分子對接技術(shù) 分子對接技術(shù)(molecular docking)是從100年前Fischer E等[18]提出的“鎖鑰模型”到二十世紀(jì)中葉Koshland DE[19]提出的“誘導(dǎo)契合理論”的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，利用配體與受體相結(jié)合的理論，從剛性對接、半柔性對接到柔性對接，逐步闡明配體與受體的結(jié)合是一個動態(tài)過程，即配體與受體誘導(dǎo)契合過程中發(fā)生構(gòu)象改變，最終形成形狀和能量最優(yōu)匹配的結(jié)合模式。

分子對接的3種方法中，剛性對接適合考察比較大的體系，比如蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，計算和原理相對簡單，主要考慮構(gòu)象之間的契合程度。半柔性對接適合于處理小分子和大分子之間的對接。在對接過程中，小分子相對較小，其構(gòu)象一般是可以變化的，因此在考察柔性的基礎(chǔ)上，還可以保持較高的計算效率。柔性對接適合于精確考察分子之間的識別情況，在提高了對接準(zhǔn)確性的同時也耗費較長的計算時間。

分子對接技術(shù)在藥物設(shè)計領(lǐng)域廣受歡迎，它既可以用來預(yù)測結(jié)合模式，還可以用來預(yù)測結(jié)合親合力。在過去的20年中涌現(xiàn)出了大量的分子對接軟件比如AutoDock、AutoDock Vina、LeDock、rDock、Flex X、UCSF DOCK、LigandFit、GLIDE、GOLD、MOE Dock、Surflex等，在小分子配體-蛋白質(zhì)分子對接、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子對接、蛋白質(zhì)-DNA分子對接、蛋白質(zhì)-RNA 分子對接中發(fā)揮重要作用[20-21]。常用的分子對接軟件及其特點見表2。

表2 常用的分子對接軟件及特點

1.3網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)在探討中藥作用機制的路線分析 從TCMSP等數(shù)據(jù)庫中篩選出藥物有效成分及靶點信息；從CTD等數(shù)據(jù)庫中篩選出疾病相關(guān)靶點；將藥物靶點信息與疾病靶點信息取交集并進行分子對接，最后利用交集基因作GO和KEGG富集分析等來研究中藥治療疾病的作用機制。見圖1。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)在

2 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法研究中藥治療腦卒中作用機制

2.1中藥治療缺血性腦卒中的作用機制研究 腦卒中已成為世界上僅次于冠心病和癌癥的第三大常見死因[22]，其中缺血性腦卒中(CIS)占所有卒中的70%～80%，是臨床最常見的卒中類型[23]。目前，溶栓已被認(rèn)為是CIS最快、最有效的治療方法，但由于適應(yīng)證嚴(yán)格、時間窗短、出血風(fēng)險高、再灌注損傷等原因，溶栓治療的臨床效果有限[24]。大量的實驗研究和臨床觀察證實，中醫(yī)藥在治療CIS方面具有獨特的優(yōu)勢，具有一定神經(jīng)保護作用[25]。向凈勻等[26]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，研究黃芩素(BE)、京尼平(GE)抗腦缺血的作用機制，發(fā)現(xiàn)以SE(燈盞花乙素苷元：對阻塞大腦中動脈所致的缺血性腦卒中動物模型發(fā)揮神經(jīng)保護作用)作為參照預(yù)測BE、GE抗腦缺血疾病靶點有 PIK3CG、CYP1A2、VEGFA、ALOX5、PTGS2，BE與GE配伍治療缺血性腦卒中主要通過抑制PTGS2(COX-2)的表達，減輕炎癥因子造成的腦組織損傷，改善血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性發(fā)揮腦保護作用。吳京霓等[27]在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)基礎(chǔ)上加用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)研究醒腦靜注射液入腦成分及其治療腦缺血損傷的作用機制，發(fā)現(xiàn)龍腦、麝香酮、樟腦、莪術(shù)二酮等13種醒腦靜注射液入腦成分和93個醒腦靜注射液治療腦缺血的作用靶點，這些靶點主要通過神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、雌激素信號通路及血管內(nèi)皮生長因子信號通路等發(fā)揮抗腦缺血損傷，并驗證了梔子苷、莪術(shù)二酮、麝香酮等代表性成分與治療腦缺血潛在靶點具有較好的親和力。黃清等[28]通過篩選神經(jīng)血管單元差異基因與“缺血性腦卒中”靶點取交集，結(jié)果得出缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元靶標(biāo)，相關(guān)的神經(jīng)血管單元靶標(biāo)236個，其中VEGFA、IL-6等為關(guān)鍵靶標(biāo)，通過GO和KEGG分析得出神經(jīng)血管單元的缺血性腦卒中相關(guān)靶標(biāo)能通過PI3K-AKT信號通路、HIF-1信號通路等多種生物過程、多個通路發(fā)揮抗腦缺血作用。馬岱朝等[29]報道了丹參多酚酸(SA)治療腦梗死的作用機制，從數(shù)據(jù)庫中篩選得到305個靶點蛋白，再與腦梗死相關(guān)靶點取交集得到335個交集基因，通過GO和KEGG富集分析得出SA可能具有激活PPAR信號通路，并拮抗FABP4發(fā)揮神經(jīng)保護作用。同時SA可能作用于IL-17 信號通路而保護血腦屏障，并可能促進IL-4合成從而達到抗炎作用，詮釋了中藥中多成分、多靶點作用機制。賈彩霞等[30]提出了大黃素對缺血性卒中干預(yù)機制的研究思路，即通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建大黃素的“腦缺血中風(fēng)-證候-靶點-成分”網(wǎng)絡(luò)，對大黃素的靶標(biāo)譜與病證分子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵模塊進行網(wǎng)絡(luò)分析，揭示大黃素可能主要通過CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9作用于細(xì)胞凋亡通路及炎癥通路等發(fā)揮治療腦缺血中風(fēng)的作用。

2.2中藥在出血性腦卒中作用機制研究 出血性腦卒中包括高血壓腦出血(ICH)、腦動脈瘤破裂出血、腦動靜脈畸形出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)等。其發(fā)病往往都有誘發(fā)因素，如情緒激動、睡眠不好、用力過度、便秘、排尿困難等。由于出血性卒中的高死亡率及預(yù)后差等因素，使得越來越多的學(xué)者探討能有效治療出血性卒中的方法。系統(tǒng)評價表明，中草藥(CHM)輔助治療不僅在缺血性腦卒中發(fā)揮重要作用，還可改善出血性腦卒中患者的神經(jīng)功能缺損、血腫體積及血腫周圍水腫體積，并且具有良好的安全性[31]。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等相關(guān)組學(xué)技術(shù)用于探討CHM在出血性卒中的作用機制，以期探索疾病與藥物更深層次的關(guān)聯(lián)。Zhang B等[32]發(fā)現(xiàn)苗藥血脈通膠囊對ICH周圍缺血區(qū)繼發(fā)性腦損傷有保護作用，血脈通膠囊(XMT)是已應(yīng)用于臨床的一種中藥，通過使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、聚類分析和富集分析篩選了XMT靶標(biāo)、化合物成分和ICH相關(guān)靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(TNF)信號通路可能是XMT治療ICH的關(guān)鍵信號通路。其次，XMT可通過調(diào)節(jié)TNF受體1(TNFR1)/CASP3抑制缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡、通過調(diào)節(jié)TNFR1/核因子κB和TNFR1/MAPK信號通路緩解炎癥和水腫及通過介導(dǎo)TNFR1/MAPK/END1減輕腦缺血區(qū)的低灌注。SAH是一種破壞性的中風(fēng)亞型，死亡率及發(fā)病率很高，即使患者在最初的出血緊急情況下幸存下來，遲發(fā)性腦缺血(DCI)也常在2周內(nèi)發(fā)生，并造成額外的嚴(yán)重腦損傷。張友剛等[33]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究腦血疏口服液治療腦出血的作用機制，通過建立單味藥-成分-靶點、交集基因蛋白質(zhì)相互作用及活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)模型，篩選出腦血疏口服液治療腦出血的活性成分56種、靶標(biāo)40個及相關(guān)通路20條，其中黃芪紫檀烷苷、槲皮素、漢黃芩素、川芎嗪、桉脂素等可能是重要物質(zhì)基礎(chǔ)，ESR1、AKT1、PIK3CA、AKT3等靶點和PI3K-Akt、腫瘤壞死因子、細(xì)胞凋亡等信號通路在治療腦出血過程中起著關(guān)鍵作用。劉輝等[34]通過Genecards數(shù)據(jù)庫、OMIM、TTD、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建了蘇合香丸的分子靶標(biāo)與SAH生物分子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)機制；通過蘇合香丸活性成分-SAH靶點網(wǎng)絡(luò)進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，篩選出與疾病網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系度最高的節(jié)點；相關(guān)文獻的體內(nèi)和體外實驗驗證，最終得出蘇合香丸有效成分可通過與SAH后一氧化氮合酶(NOS)結(jié)合減少NO的產(chǎn)生，降低認(rèn)知功能障礙的發(fā)生；同時與兒茶酚胺及其受體的結(jié)合而有效發(fā)揮“醒腦開竅”的作用。

3 結(jié)語

越來越多的科研工作者采用組學(xué)間聯(lián)合的方法進行藥物靶點及作用機制研究，如上述學(xué)者在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上聯(lián)合分子對接技術(shù)得出中藥及其復(fù)方制劑的有效成分及其作用靶點，基于“藥物-靶點-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化分析及相關(guān)疾病靶蛋白的構(gòu)建，初步闡明了中藥治療腦卒中的作用機制，驗證中藥藥效的微觀生物學(xué)基礎(chǔ)，優(yōu)化和評價已知中藥(復(fù)方)的臨床療效。目前還有少數(shù)學(xué)者采用的細(xì)胞及動物實驗對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接結(jié)果進行驗證，在一定程度上驗證了該法的可行性及可靠性，李文標(biāo)等[35]采用了Western blot方法驗證炙黃芪拮抗阿霉素心肌損傷作用機制，發(fā)現(xiàn)炙黃芪可通過抑制JNK/c-Jun/c-Fos通路進而減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，從而拮抗阿霉素造成的心肌損傷。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)的迅速發(fā)展體現(xiàn)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥模式的轉(zhuǎn)變，但也面臨諸多挑戰(zhàn)，如中藥及其復(fù)方制劑中成分多，篩選困難，數(shù)據(jù)庫中的關(guān)鍵靶點及藥效成分作用機制不明確，現(xiàn)有的分子對接軟件程序復(fù)雜，分子對接的評價方法不完善等。雖然通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討了中藥在腦卒中作用機制，但實驗驗證相關(guān)報道較少，仍需大量的體內(nèi)、體外實驗加以闡釋。