柱前衍生法測(cè)定巖藻多糖中的巖藻糖含量

周宏霞，王 楠，都 穎，王 妙，張 羽

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，山東 威海 264200）

巖藻多糖也稱褐藻多糖硫酸酯，是以巖藻糖和硫酸基為主要特征的一類水溶性多糖。Kylin在1913年首次從掌狀海帶中提取，并命名為Fucoidin，現(xiàn)在已統(tǒng)一定名為巖藻多糖（Fucoidan）或巖藻聚糖硫酸酯（Sulfated Fucan）[1]。以海帶、裙帶菜等褐藻為原料，經(jīng)精制提取可以得到多糖類產(chǎn)品——巖藻多糖[2]。巖藻多糖具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等活性，是一種重要的生物活性物質(zhì)[3-5]。L-巖藻糖是影響巖藻聚糖生物活性的重要組成成分，巖藻聚糖硫酸酯的重要指標(biāo)性成分。而且L-巖藻糖作為巖藻聚糖的特征單糖，常用于衡量巖藻聚糖的純度[6]。因此，在測(cè)定褐藻制品中巖藻糖含量時(shí)，以測(cè)定L-巖藻糖的含量來(lái)表示。目前，檢測(cè)巖藻糖的方法有氣相色譜法[7-9]、高效液相色譜-柱前衍生化紫外檢測(cè)法[10]或蒸發(fā)光法[11]、離子色譜法[6]等。其中，高效液色譜-柱前衍生化紫外檢測(cè)法用的比較廣泛。在SC/T 3404—2012中有關(guān)于巖藻糖測(cè)定的方法，但是應(yīng)用該方法進(jìn)行衍生，生成的衍生物質(zhì)不大穩(wěn)定，造成結(jié)果重現(xiàn)性不好。在該方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)與研究，建立了一種比較穩(wěn)定的柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定L-巖藻糖的方法。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)試劑

乙腈、甲醇（色譜純，Thermo）；磷酸二氫鉀（優(yōu)級(jí)純）；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（≥99.0%，麥克林）；三氟乙酸（優(yōu)級(jí)純）；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）；三氯甲烷（色譜純）；冰乙酸（色譜純）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）；氨水（分析純）；L-巖藻糖（L/Stanford Chemicals，≥99.5%）；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 試劑配制

4 mol/L三氟乙酸溶液：準(zhǔn)確量取三氟乙酸溶液29.7 mL，加水定容至100 mL。4 mol/L氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取氫氧化鈉16.0 g，加水溶解并定容至100 mL。0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀1.36 g，加水80 mL溶解，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.0，再用水定容至100 mL。0.5 mol/LPMP甲醇溶液：準(zhǔn)確稱取PMP 8.71 g，用甲醇溶解并定容至100 mL。0.3 mol/L氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取1.2 g氫氧化鈉，加水溶解并定容至100 mL。0.3 mol/L鹽酸溶液：準(zhǔn)確移取鹽酸溶液2.5 mL，用水稀釋至100 mL。0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加80 mL水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，再用水定容至1 000 mL，備用。L-巖藻糖溶液配制：精密稱取L-巖藻糖10 mg，用水溶解定容至10 mL，配制成濃度為1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液。

1.3 儀器

高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器；分析天平；渦旋混合器；電熱恒溫干燥箱；恒溫水浴鍋；超聲波清洗器，Mili-Q超純水機(jī)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱（C18柱，Venusil MP 4.6 mm×250 mm，5 μm，艾杰爾科技有限公司），柱溫為40℃，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）-乙腈（體積比為85∶15），檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 巖藻多糖的水解

準(zhǔn)確稱取巖藻多糖樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸溶液10 mL，混勻后充入氮?dú)夥馍w，在110℃電熱恒溫干燥箱中水解2 h，取出后冷卻至室溫，加入4 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL中和，調(diào)節(jié)pH值至中性。將水解液轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液定容至刻度，備用。根據(jù)樣品中巖藻糖含量的不同可以進(jìn)行不同濃度的稀釋。

2.3 試樣的衍生及凈化

準(zhǔn)確移取定容后的水解液450 μL于10 mL塑料離心管中，加入0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液450 μL和0.3 mol/L氫氧化鈉溶液450 μL，渦旋混合，70℃水浴反應(yīng)70 min，取出冷卻至室溫，加0.3 mol/L鹽酸溶液450 μL，渦旋混合，加三氯甲烷溶液2 mL，充分振蕩，靜置分層，吸棄下層三氯甲烷層，重復(fù)萃取2次。上清液過(guò)0.45 μm的濾膜，供高效液相色譜儀分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化

準(zhǔn)確移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水稀釋成1，5，10，50，100，200，500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別取450 μL于10 mL塑料離心管中，按照2.3的操作進(jìn)行衍生化，上機(jī)檢測(cè)，繪制校準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與分析

3.1 衍生條件的優(yōu)化

采用相同的衍生液、衍生溫度和衍生時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用鹽酸溶液中和的穩(wěn)定性要優(yōu)于醋酸溶液中和。王澤文等人[10]對(duì)巖藻糖的衍生溫度和衍生時(shí)間進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，采用70℃反應(yīng)70 min能充分反應(yīng)完全。因此采用了70℃水浴反應(yīng)70 min。衍生反應(yīng)后，由于PMP試劑在波長(zhǎng)245 nm處有很大的紫外吸收，為防止試驗(yàn)中PMP殘留對(duì)衍生物檢測(cè)的干擾，在試驗(yàn)中用三氯甲烷去除剩余的PMP。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

采用磷酸鹽緩沖液（pH值6.8）-乙腈（體積比為85∶15）為流動(dòng)相，在該條件下目標(biāo)物質(zhì)和雜質(zhì)能很好地分離。檢測(cè)器采用二極管陣列檢測(cè)器，采集光譜圖，通過(guò)頂點(diǎn)的光譜圖的不同，可以很好地區(qū)分巖藻糖和雜質(zhì)。

巖藻糖衍生物譜圖見(jiàn)圖1，巖藻糖衍生物光譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 巖藻糖衍生物譜圖

圖2 巖藻糖衍生物光譜圖

3.3 線性關(guān)系考查

按照2.1色譜條件，分別測(cè)定L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度測(cè)定1次，記錄L-巖藻糖色譜峰面積，以L-巖藻糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度X（μg/mL）為自變量、色譜峰面積Y為因變量，進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=0.673 9X+2.281 6，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，表明L-巖藻糖的質(zhì)量濃度在1～500 μg/mL范圍與色譜峰面積線性關(guān)系。

巖藻糖校準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 巖藻糖校準(zhǔn)曲線

3.4 精密度試驗(yàn)（n=6）

取100 μg/mL L-巖藻糖，按照2.3方法進(jìn)行衍生，精密吸取20 μL該溶液，進(jìn)樣后測(cè)得色譜峰面積，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果為：RSD為0.73%，說(shuō)明儀器有良好的精密度。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

稱取100 μg/mL L-巖藻糖，按照2.3方法進(jìn)行衍生，精密吸取20 μL該溶液，在0，4，8，10，12，24 h依次進(jìn)樣一次，測(cè)定峰面積值，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果為：RSD為0.58%。說(shuō)明該對(duì)照品溶液的衍生化在24 h有良好的穩(wěn)定性。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

準(zhǔn)確稱取巖藻多糖樣品0.1 g 6份樣品，按照本文的方法進(jìn)行水解和衍生，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果為：2.68%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取巖藻糖濃度為15.6%的巖藻多糖樣品0.1 g 6份，加入巖藻多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中的加標(biāo)濃度為15%，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行水解和衍生，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為94.7%和5.27%。

巖藻糖回收率試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 巖藻糖回收率試驗(yàn)/%

4 結(jié)論

采用PMP柱前衍生法和高效液相色譜法對(duì)巖藻多糖中的L-巖藻糖質(zhì)量濃度進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果表明，該方法測(cè)定L-巖藻糖質(zhì)量濃度簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果的穩(wěn)定性，重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。PMP衍生單糖后使其帶上發(fā)色基團(tuán)，從而有紫外吸收，采用二極管陣列檢測(cè)器能得到樣品中物質(zhì)的光譜圖，可以很好地區(qū)分巖藻糖衍生物和雜質(zhì)。通過(guò)該方法的測(cè)定，可以得到巖藻多糖中L-巖藻糖的含量，從而判定該產(chǎn)品是否符合巖藻多糖的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到對(duì)巖藻多糖產(chǎn)品質(zhì)量的控制。