羊乳中摻入牛乳的鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

岳明星，簡偉杰，陳 思，李 浡，危 晴，陳 亮，辛秀蘭

（北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100176）

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羊乳與人乳蛋白質(zhì)組成相似，氨基酸比例接母乳，營養(yǎng)成分均衡，消化時(shí)間短。另外，羊乳脂肪球小，中短鏈脂肪酸含量高，易于人體消化吸收，更適合嬰兒、中老年人食用。羊乳可降低嬰幼兒發(fā)生過敏的幾率，與牛乳相比，羊乳含有更多易于消化吸收的a-乳清蛋白，含有較少的致敏蛋白αs1-酪蛋白，可解除或緩解大部分寶寶因牛奶蛋白引起的過敏癥。同時(shí)，羊奶中免疫球蛋白、核苷酸等天然成分含量也比較高，對(duì)嬰幼兒的生長發(fā)育大有益處。因此，羊乳以其營養(yǎng)豐富、易于吸收等優(yōu)點(diǎn)被稱為“奶中之王”，是世界上公認(rèn)的最接近于人奶的乳品[1]。

但羊乳產(chǎn)量低、養(yǎng)殖要求高，價(jià)格高于牛乳。莎能奶山羊產(chǎn)奶量最高，年產(chǎn)奶量僅為600~1 200 kg，而一頭荷斯坦奶牛平均年產(chǎn)7 000~10 000 kg，最高可達(dá)12 000 kg。因?yàn)檠蚰痰馁Y源相對(duì)牛奶要珍貴很多，奶山羊與奶牛對(duì)生存環(huán)境的要求不同，奶牛適宜圈養(yǎng)，喂人工飼料，而奶山羊適宜放牧養(yǎng)殖，以吃青草和干草為主，不喂人工飼料。在國際市場上羊奶比牛奶普遍貴2~5倍。另外，羊奶具有極高的營養(yǎng)價(jià)值、醫(yī)療保健價(jià)值和美容護(hù)膚價(jià)值。因此，羊奶價(jià)格比牛奶高的事實(shí)很難改變。

在國際市場，羊乳產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的增長勢頭。近年來，我國的羊乳制品在市場上得到了消費(fèi)者的認(rèn)可，不少消費(fèi)者選擇了喝羊乳。嬰幼兒羊乳粉的價(jià)格也普遍高于牛乳粉。

近年來，隨著羊乳消費(fèi)人數(shù)的增加和消費(fèi)市場的不斷擴(kuò)大，在羊乳中摻入牛乳的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。為了降低成本、提高供應(yīng)量，一些不法商販在羊乳及羊乳制品（如奶粉、酸奶、奶酪等）中摻牛乳成分冒充羊乳，以此來欺騙消費(fèi)者。同時(shí)，羊乳中摻入牛乳的行為可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)牛乳過敏者不知情況下誤食，發(fā)生過敏反應(yīng)，危害消費(fèi)者健康與嬰幼兒的生命安全[2]。

針對(duì)這一問題，如何快速鑒別羊乳中摻入牛乳，對(duì)保障消費(fèi)者安全、保護(hù)守法羊乳企業(yè)的合法權(quán)益具有重要意義。如何快速鑒別羊乳及其制品中摻入牛乳源成分，保證羊乳的營養(yǎng)健康和質(zhì)量安全對(duì)維護(hù)羊乳制品消費(fèi)市場健康可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。從電泳法、免疫法、色譜法等方面鑒別分析了羊乳中摻入牛乳，對(duì)不同方法的靈敏度、檢出限進(jìn)行了對(duì)比。

1 羊乳與牛乳主要組分比較

鑒別之前，熟知羊乳和牛乳組分含量差異是非常必要的，以找到合適的標(biāo)記成分進(jìn)行鑒別摻假。

羊乳與牛乳中蛋白質(zhì)種類及含量[3]見表1。

表1 羊乳與牛乳中蛋白質(zhì)種類及含量/g·（100 g蛋白質(zhì)）-1

從表1可看出，羊奶與牛奶組成相近，但其各組分含量存在差別，因此這些組分差距是建立鑒別方法的依據(jù)。

2 電泳法

2.1 聚丙烯凝膠電泳法（SDS-PAGE）

SDS-PAGE是分析蛋白的一種常用技術(shù)，技術(shù)原理是通過各種蛋白分子量大小、攜帶電荷數(shù)的不同導(dǎo)致的遷移速率不同而進(jìn)行分離。Tamimed A Y等人[4]利用SDS-PAGE法對(duì)αs1-酪蛋白進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)牛乳中αs1-酪蛋白的遷移速率顯著高于羊乳中αs1-酪蛋白。Kaminarides S E等人[5]利用牛乳酸乳中的副κ-酪蛋白為標(biāo)記成分，對(duì)羊乳酸乳進(jìn)行檢測，牛乳檢出限為1%。Veloso A C A等人[6]采用尿素-PAGE法根據(jù)牛乳αs-酪蛋白組成不同于羊乳，可將混入羊乳中5%的牛乳檢出。

2.2 等電點(diǎn)聚焦（IEF）

等電點(diǎn)聚焦是根據(jù)蛋白等電點(diǎn)主要對(duì)不同基因變異體的酪蛋白進(jìn)行分離。該方法對(duì)山羊原料乳和乳制品中摻牛乳的檢出均有很高的靈敏度。依據(jù)的主要標(biāo)記成分是γ-caseins的水解產(chǎn)物，γ2-caseins和γ3-caseins，這2種蛋白的等電點(diǎn)范圍在pH值6.5~7.5。該方法的檢出靈敏度可達(dá)到0.5%[7]，缺點(diǎn)是不適用鑒別羊乳中摻入牛乳清濃縮蛋白。

2.3 毛細(xì)管電泳（CE）

毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細(xì)管電泳，是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。長期困擾生物大分子（如蛋白質(zhì)）的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。

毛細(xì)管電泳在乳制品檢測分析中，可對(duì)乳清蛋白和酪蛋白進(jìn)行有效分離和精準(zhǔn)的定量。Cartoni G等人[8]開展采用毛細(xì)管電泳法鑒別了羊乳制品中摻入的牛乳源性成分。以pH值9.2的硼酸鈉為背景電解質(zhì)，利用甲基硅烷毛細(xì)管，目標(biāo)蛋白峰具有很好的分辨率?；旌弦后w乳樣品中牛乳的最低檢出限2%，混合奶酪樣品中檢出體積分?jǐn)?shù)為4%。個(gè)體遺傳差異和熱處理會(huì)影響檢測結(jié)果。

De Jong N等人[9]已成功將羊乳中摻入的牛乳（＞1%）檢出。Molina E等人[10]分析混合乳中酪蛋白的毛細(xì)管電泳圖，利用偏最小二乘回歸法和主成分回歸分析法，對(duì)獲得的目標(biāo)蛋白峰進(jìn)行了判定，采用二次多項(xiàng)式模式分析時(shí)，不同品種乳制品含量百分比的均方根預(yù)測誤差低于2.4%。毛細(xì)管電泳的出現(xiàn)將αs1-酪蛋白作為標(biāo)記組分，可以使混入牛奶的檢出限從8%降到1%[11]。此外，β-酪蛋白、κ-酪蛋白也可作為指紋成分[12]。

電泳法鑒別羊乳和牛乳的標(biāo)記組分見表2。

表2 電泳法鑒別羊乳和牛乳的標(biāo)記組分

3 PCR技術(shù)

根據(jù)對(duì)不同動(dòng)物組織中存在的特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，根據(jù)不同動(dòng)物組織中特異性序列的差異進(jìn)而達(dá)到鑒別乳品種的目的。Lopez-Calleja I等人[13]利用針對(duì)線粒體12S rRNA的基因引物，建立了對(duì)綿羊和山羊奶中摻入牛奶的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）鑒定方法。利用與保守DNA序列互補(bǔ)的正向引物，以及針對(duì)奶牛的反向引物，從牛奶的DNA中獲得了一個(gè)223 bp的特定片段，而在綿羊和山羊奶DNA中沒有獲得擴(kuò)增信號(hào)。該技術(shù)應(yīng)用于原料乳、巴氏殺菌乳和常溫牛羊混合奶，使對(duì)牛奶的特異性檢測具有良好的靈敏度閾值（0.1%）。該技術(shù)建立的PCR檢測方法是一種快速、直接的方法，適用于牛奶和其他乳制品的常規(guī)鑒定分析。Bania J等人[14]和Maudet C等人[15]已成功采用PCR技術(shù)，將混入羊乳及羊乳奶酪中的牛乳檢出，且檢出限可達(dá)到0.1%。

基于DNA的穩(wěn)定性，經(jīng)過高溫處理的乳樣也可以達(dá)到此檢出限。目前，已發(fā)展出一種連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）和酶免疫測定（EIA）相結(jié)合的PCR技術(shù)。以不同于綿羊和山羊乳的牛乳中β-酪蛋白中8411位基因?yàn)榛A(chǔ)，提取DNA，PCR擴(kuò)增β-酪蛋白，以擴(kuò)增得到的片段為模板，進(jìn)一步和不同品種乳特異性引物進(jìn)行LCR反應(yīng)，檢測出牛乳[16]。以DNA為基礎(chǔ)的檢測方法的優(yōu)點(diǎn)就是靈敏性高、檢測速度快。由于DNA是來自于體細(xì)胞，而體細(xì)胞的計(jì)數(shù)會(huì)受許多因素的影響，導(dǎo)致該方法難以準(zhǔn)確定量牛乳的含量。

4 ELISA酶聯(lián)免疫法

近年來，隨著免疫學(xué)技術(shù)的成熟和發(fā)展，利用ELISA方法在羊乳中定量檢測摻入的牛乳成分受到越來越多的關(guān)注。該方法的原理主要是利用特定單抗和多抗與乳清蛋白（牛β-Lg，羊乳清）、酪蛋白（牛β-casein，κ-casein，αs1-casein）及酪蛋白水解肽發(fā)生特異性反應(yīng)，達(dá)到檢測目的，其檢測靈敏度可低于0.5%。和其他技術(shù)相比，ELISA方法操作簡單、靈敏高、檢測成本低，缺點(diǎn)就是該方法耗時(shí)長、要求較高的抗血清濃度[17]。

Hurley I P等人[18]開發(fā)了一種間接競爭性ELISA方法，用于快速鑒別山羊、綿羊和水牛奶中的摻入牛奶。該試驗(yàn)使用了一種針對(duì)牛IgG產(chǎn)生的單克隆抗體，該抗體可識(shí)別牛IgG和IgG重鏈上的一個(gè)物種特異性表位。使用過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體檢測結(jié)合的單克隆抗體，隨后底物在酶的作用下，通過測定不同摻假乳樣混合物時(shí)，吸光度有明顯差異。ELISA方法具有高度特異性的。該檢測方法的檢測限為1.0 g/mL牛IgG，或0.1%的牛乳檢測限。該方法具有較高的重復(fù)性，適用于高通量篩選。此外，夾心-ELISA法[19-20]在檢測牛乳成分方面得到廣泛應(yīng)用。

薛海燕等人[21]在羊乳中摻入牛乳的間接ELISA定量檢測時(shí)選擇抗β-酪蛋白多克隆血清，間接ELISA法用于原乳檢測時(shí)，摻入牛乳的百分含量與A450 nm在4%~50%呈線性關(guān)系，該方法的最低檢出量為4%。所建立的ELISA方法變異系數(shù)＜5%，回收率在94%~105%，符合方法學(xué)要求，可用于牛乳摻假的定量檢測。對(duì)滅菌乳的檢測表明，熱處理不改變?chǔ)?酪蛋白與抗體反應(yīng)的特性，方法還可用于經(jīng)熱加工的乳品檢測中。

以ELISA原理開發(fā)的快檢試劑盒具有準(zhǔn)確度高、專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，操作方便，不需要特殊的儀器設(shè)備，可同時(shí)對(duì)幾十個(gè)甚至上百個(gè)樣品進(jìn)行檢測，避免了常規(guī)檢測方法存在的耗時(shí)長、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此，該方法適合乳品質(zhì)量安全現(xiàn)場快速檢測，是乳品摻假檢測技術(shù)的重要手段。

ELISA技術(shù)鑒別羊乳中的摻入牛源性成分見表3。

表3 ELISA技術(shù)鑒別羊乳中的摻入牛源性成分

5 色譜技術(shù)

5.1 液相色譜HPLC

HPLC分析技術(shù)是鑒別羊乳中摻入牛乳的另一項(xiàng)技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢在于其高速、簡單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。目前，反向色譜（RP-HPLC）、離子交換色譜、疏水性液相色譜均可用于分析乳蛋白。RPHPLC主要用于分析乳中的乳清蛋白（α-La，β-Lg和BSA），根據(jù)羊乳和牛乳中各種乳清蛋白的保留時(shí)間不同進(jìn)行區(qū)分[22]。Veloso A C A等人[6]也采用RPHPLC技術(shù)成功以α-casein為標(biāo)記成分，檢測出羊乳中摻入5%的牛乳。疏水交互作用色譜（HIC）與強(qiáng)變性劑結(jié)合，分析酪蛋白的峰面積比值，如αs1酪蛋白/κ酪蛋白，αs2酪蛋白/β酪蛋白，β酪蛋白/κ酪蛋白，αs2酪蛋白/αs1酪蛋白，作為檢測羊乳中摻入牛乳的指標(biāo)[23]。

液質(zhì)聯(lián)用的新技術(shù)，目前在檢出牛乳方面得到發(fā)展和應(yīng)用。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)建立的牛乳指紋圖譜，可以快速、簡單地對(duì)蛋白樣品進(jìn)行檢測。Cozzolino R等人[24]使用基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜（MALDI MS）以牛β-乳球蛋白A和B為標(biāo)記成分成功準(zhǔn)確檢出羊奶中混入的牛奶。

5.2 氣相色譜

低分子量脂肪酸在羊乳和牛乳的脂肪中含量均比較高。但羊乳中C6∶0，C8∶0，C10∶0，C12∶0，C14∶0直鏈脂肪酸含量均高于牛乳，其中C10∶0直鏈脂肪酸含量的差別最為顯著。以此為基礎(chǔ)，可以檢測羊乳產(chǎn)品中摻入的牛乳。

葛武鵬等人[25]分析牛、羊乳及其酸乳、奶酪脂肪酸組成及變化特點(diǎn)，羊乳及其制品的脂肪酸質(zhì)量優(yōu)于牛乳及其制品，牛、羊乳加工后長鏈飽和脂肪酸含量降低，短鏈飽和脂肪酸含量增加。Benassi建立了基于C12/C10比值的檢測技術(shù)，當(dāng)羊乳中摻入牛乳的含量在15%~20%時(shí)都可以檢測出來。相關(guān)研究表明，基于C4/C6+C8和C12/C10的比例可以定量檢測羊乳及其制品中摻入的牛乳成分。

6 光譜技術(shù)

近紅外光譜技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)高速、高效分析技術(shù)。褚瑩等人[26]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量方法，快速鑒別摻假羊乳。分別對(duì)用偏最小二乘差別分析（PLS-DA），fisher線性辨別和多層感知器（MLP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法建立校正的模型進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證。其中，MLP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法鑒別效果最佳，正確率可達(dá)100%。近紅外光譜技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量學(xué)法，實(shí)現(xiàn)羊奶摻假檢測的快速無損鑒別。

7 感官法

目前，采用電子舌對(duì)羊乳的真假進(jìn)行鑒別也成為一種新型技術(shù)。電子舌有36個(gè)交叉靈敏的傳感器，可成功辨別5種基本的味道。Dias L A等人[27]將電子舌設(shè)備與線性判別分析相結(jié)合，測定記錄不同數(shù)據(jù)信號(hào)，建立模型，進(jìn)而對(duì)脫脂乳中是否摻有牛乳進(jìn)行辨別，其中辨別靈敏度和特異性分別可達(dá)到97%和93%。

8 結(jié)語

羊乳制品作為新興的乳制品，正逐漸被廣大消費(fèi)者接受，未來具有廣闊的市場前景。因此，針對(duì)羊乳制品中摻入牛乳這一檢測需求，選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快的鑒別方法，對(duì)確保我國羊乳營養(yǎng)品質(zhì)、質(zhì)量安全水平、產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。通過對(duì)以上各種方法進(jìn)行比較，在將來快速、簡單、無損、實(shí)時(shí)性、低成本的方法還有待繼續(xù)探索與推廣。