沈曄 李茜 鄭悅亮 韓楠楠 陳環(huán) 王圣果

[摘要] 目的 通過氣管內(nèi)滴注脂多糖建立小鼠急性肺損傷模型，探討黃芪對急性肺損傷的保護作用及其療效評估。方法 將小鼠隨機分為正常對照組（氣管內(nèi)滴注無菌PBS 60 μl）、模型組（LPS組，氣管內(nèi)滴注0.5 mg/kg，LPS 100 μl，作用24 h）、黃芪治療組（0.75 g/L RA+LPS組），觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞計數(shù)變化、測定蛋白含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。分離肺組織以評估濕/干重比，Western blot 法檢測促炎細(xì)胞因子的mRNA表達和組織學(xué)變化。 結(jié)果 與模型組相比，黃芪治療組BALF中總細(xì)胞數(shù)及蛋白質(zhì)含量比值明顯降低（P<0.01）;黃芪治療組小鼠右肺中葉W/D比值明顯降低（P<0.01）;小鼠血清SOD活性含量明顯高于模型組（P<0.01）。在肺泡灌洗液檢測中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，黃芪治療組TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。病理組織學(xué)提示黃芪治療組可顯著減輕肺組織損傷。 結(jié)論 黃芪能夠顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥，對小鼠急性肺損傷有很強的保護作用。

[關(guān)鍵詞] 急性肺損傷;黃芪：脂多糖;炎癥細(xì)胞遷移

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）01-0038-04

Study on the mechanism of radix astragali on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice

SHEN Ye1? ?LI Qian1? ?ZHENG Yueliang1? ?HAN Nannan1? ?CHEN Huan1? ?WANG Shengguo2

1.Department of Emergency Medicine， Zhejiang Provincial People′s Hospital， Hangzhou? ?310014， China; 2.Department of Emergency， the First People′s Hospital of Jiashan County in Zhejiang Province， Jiashan? ?314100， China

[Abstract] Objective To establish a mouse model of acute lung injury by intratracheal instillation of lipopolysaccharide， and to explore the protective effect of radix astragali on acute lung injury and the evaluation of curative effect. Methods The mice were randomly divided into the normal control group （intratracheal instillation of 60 μl of sterile PBS）， the model group （LPS group， intratracheal instillation of 0.5 mg/kg， 100 μl of LPS for 24 h） and the radix astragali treatment group （0.75 g/L RA+LPS group）. The histopathological changes of lung tissue， the changes of cell count in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were observed. The protein content and the activity of superoxide dismutase （SOD） were measured. Lung tissues were isolated to assess the wet/dry weight ratio.The mRNA expression and histological changes of proinflammatory cytokines were detected by Western blot. Results Compared with LPS model group， the total cell count and protein content ratio in BALF of radix astragali treatment group were significantly decreased（P<0.01）. The W/D ratio in the right middle lobe of mice in radix astragali treatment group was significantly decreased（P<0.01）. The SOD activity content in serum of mice in radix astragali treatment group was significantly higher than that of LPS group（P<0.01）. The bronchoalveolar lavage fluid examination found that the contents of TNF-α， IL-1β， and IL-6 were significantly lower in the radix astragali treatment group compared with the model group（P<0.01）， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Histopathology suggested that the astragalus treatment group significantly reduced lung tissue injury. Conclusion Radix astragali can significantly reduce LPS-induced pulmonary inflammation and has a strong protective effect on acute lung injury in mice.

[Key words] Acute lung injury; Radix astragali; Lipopolysaccharide; Inflammatory cell migration

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由各種肺內(nèi)外因素致血管通透性持續(xù)增加、彌漫性肺臟炎癥損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征[1]。革蘭陰性細(xì)菌感染作為ALI發(fā)生的重要原因之一，其主要的的致病成分脂多糖（LPS）可誘導(dǎo)顯著的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，此二者被認(rèn)為在ALI發(fā)病機制中居重要地位[2]。因此，靶向控制氧化應(yīng)激和炎癥應(yīng)答的治療手段有可能為臨床防治ALI提供新的思路。黃芪（radix astragali，RA）是我國傳統(tǒng)中草藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬用藥上品，具有益氣、祛邪、扶正，歸脾、肺經(jīng)，補氣升陽、益衛(wèi)固表之功效[3]。RA具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抑菌，心臟神經(jīng)保護作用等[3]。本實驗擬通過觀察RA對LPS致小鼠肺損傷后肺組織病理性變化、肺泡灌洗液中細(xì)胞計數(shù)變化、炎癥因子表達的變化，探索其對急性肺損傷的保護作用，為臨床治療提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 試劑? LPS（Sigma Chemical公司）;Trizol分離試劑（Invitrogen公司）;IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒（上海斯信生物科技股份有限公司）;實時熒光定量PCR試劑（杭州博日科技有限公司）;MPO、SOD檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。黃芪購買于本院中醫(yī)藥庫。

1.1.2 動物實驗? 健康雄性SOD小鼠60只，體重150～200 g。本動物實驗在浙江省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心進行。動物許可證號：SYXK（浙）2018-0012。所有的操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。動物在實驗前自由進食和進水。將RA以10 mmol/L溶解于DMSO中作為儲備濃度。在使用前立即將過硫酸銨（APS）原液稀釋于無菌生理鹽水中（最終DMSO濃度為0.1%）。根據(jù)文獻本研究選擇質(zhì)量濃度0.75 g/L作為RA的最終劑量。

1.2 方法

1.2.1 ALI小鼠模型建立和實驗方案? 將小鼠隨機分成：正常對照組（NS組）、模型組（LPS組）、黃芪治療組（RA組）和地塞米松陽性對照組（DEX組，5 mg/kg）四組，每組12只。黃芪治療組小鼠分別予按千克體重15 mL黃芪提取物懸濁液（體重濃度0.75 g/L）進行灌胃，1次/d。模型組、正常對照組給予等量生理鹽水灌胃。地塞米松陽性對照組在造模前1 h給予地塞米松5 mg/kg灌胃，連續(xù)灌胃30 d。第31天，除正常對照組外，其余各組小鼠均經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液[80 mg/（kg·bw）]麻醉，采用經(jīng)口氣管插管后氣道內(nèi)滴入LPS（0.5 mg/kg，100 μL）建立小鼠ALI模型[4]。

1.2.2 組織病理學(xué)分析? HE染色小鼠肺組織及病理評分，并測定小鼠肺組織濕/干重比：造模24 h后將小鼠麻醉后股動脈放血處死，暴露氣管，結(jié)扎左肺，用 4%多聚甲醛固定左肺組織樣本24 h，采用乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm）。切片進行HE染色后并進行肺組織學(xué)檢查;取右肺稱重（濕重），置60℃烘箱48 h后稱干重，肺濕重/干重比值代表了肺水含量，根據(jù)（濕重-干重）/濕重公式計算肺水含量。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液分析? 提取肺泡灌洗液，檢測小鼠BALF中總蛋白及LDH的水平，并檢測小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)：各組小鼠氣管插管后行肺泡灌洗，提取3次肺泡灌洗液共1.2 ml，在4℃下以5000 rpm離心10 min來對BALF進行固化?；厥盏姆闻莨嘞匆弘x心后，吸取上清液檢測細(xì)胞因子、SOD活性。去掉BALF的上清液后，細(xì)胞沉淀用PBS溶液計數(shù)總細(xì)胞數(shù)與中性粒細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 肺組織MPO活性檢測? BALF上清和肺組織中勻漿在4℃，10 000 rpm離心15 min，取其上清液，分別取各組小鼠的肺組織，在冰上使用勻漿器充分勻漿組織后10 000 r/min離心10 min，收集離心后上清，即為肺組織勻漿液。依照試劑盒說明書的操作步驟測定組織勻漿液在480 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值計算肺組織的MPO活性。操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 細(xì)胞因子mRNA表達的測定? 用研磨器將收集右肺中葉組織研碎，取0.1 ml肺組織加入1 ml左右Trizol勻漿。勻漿液置于4℃，12 000 rpm離心，取上清液。按照Trizol法上清液依次加入氯仿、異丙醇，冷75%乙醇（DEPC水配置）混合均勻，棄上清。每管中加入20 ml DEPC處理的水，使總RNA溶解，經(jīng)核酸紫外分析儀檢測，根據(jù)A260/A280b比值，確定樣品中RNA純度及含量。提取各組小鼠右肺的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用real-time PCR儀擴增檢測Ct值。PCR產(chǎn)物檢測采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為陽性對照，采用2-△△ct法計算肺組織TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA與內(nèi)參基因的比值。本文中引物序列為：TNF-α的上下游引物分別為：5’-AAATGGGCTCCCTCTA-TCAGTTC-3’，5’-TCTGCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3’，IL-6的上下游引物分別為5-TCCTACCCAACTTCCAATGCTC-3’，5’-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3’，IL-1Β的上下游引物分別為：5’-GCTTCAGGCA-GGCAGTAT-3’，5’-ACAAACCGCTTTTC-CATCT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷

正常對照組小鼠肺組織、肺泡間隔正常，肺泡腔內(nèi)無滲出物;LPS組小鼠表現(xiàn)為肺泡間隔明顯增厚、間質(zhì)水腫、肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)破壞為特征的肺組織彌漫性病變。與地塞米松（Dex）相似，黃芪各組小鼠肺泡間隔增厚，但較LPS損傷減輕，且高劑量黃芪組較低劑量組損傷輕。見封三圖7。

2.2 黃芪顯著抑制小鼠ALI模型中LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

黃芪可減少ALI小鼠肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤，與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞數(shù)顯著增加，而淋巴細(xì)胞計數(shù)降低（P<0.05）。見表1、圖1。經(jīng)重復(fù)測量方差分析，不同治療組間總細(xì)胞計數(shù)（F=69.9537，P<0.001），中性粒細(xì)胞計數(shù)（F=684.74，P<0.001）;淋巴細(xì)胞在不同治療組的水平顯示（F=1324.26，P<0.001），巨噬細(xì)胞計數(shù)（F=735.965，P<0.001），各組間效應(yīng)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與LPS組比較，RA組及DEX組BALF中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)則明顯減少，提示黃芪及DEX明顯抑制了LPS刺激下的炎癥細(xì)胞滲出。

2.3 黃芪可減輕ALI小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的表達

與正常對照組相比，LPS誘導(dǎo)后的小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著升高（P<0.01），而黃芪和DEX干預(yù)后均可抑制肺組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達（P<0.01）。結(jié)果提示，黃芪可通過抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，減少炎癥細(xì)胞聚集，從而減輕肺損傷。見圖2。

2.4 黃芪可有效降低ALI小鼠血管通透性

LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺濕/干重比和總蛋白含量明顯增高。見圖3A。而RA組及DEX組均可顯著抑制LPS引起的BALF總蛋白濃度升高（P<0.01）。見圖3B。因此黃芪可明顯降低LPS誘導(dǎo)小鼠ALI模型中的肺濕/干重比及蛋白滲漏，有效降低血管通透性。

A：LPS組、黃芪治療組各小鼠組間不同肺濕/干重比統(tǒng)計學(xué)分析B：各組小鼠BALF總蛋白含量統(tǒng)計學(xué)分析。與LPS治療組相比，黃芪治療組肺濕/干重比及BALF總蛋白含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。*P<0.05，**P<0.01 vs. LPS，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2.5 黃芪顯著抑制ALI模型中LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

本研究通過測量超氧化物歧化酶（SOD）活性來確定黃芪對LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中的氧化應(yīng)激的影響（圖4）。與NS組、RA組相比，LPS組SOD活性顯著降低（P<0.01）。與NS組相比，RA組SOD活性顯著增加（P<0.01），表明黃芪具有優(yōu)異的抗氧化能力，可能通過抑制氧化應(yīng)激來減輕肺損傷。

3 討論

ALI是各種肺內(nèi)、肺外因素導(dǎo)致的急性彌漫性炎癥性肺損傷綜合征，其中肺內(nèi)炎癥細(xì)胞的過度活化，炎癥因子瀑布性釋放和氧化應(yīng)激是早期急性肺損傷發(fā)病機制中關(guān)鍵的因素[5]。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜上的的主要成分之一，可誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答，激活白細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。因此LPS常用于誘導(dǎo)ALI的動物模型[6]。

LPS給小鼠氣管內(nèi)直接滴入可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，引起一系列的前炎因子釋放，最終導(dǎo)致肺部急性炎癥反應(yīng)[7-8]。本研究通過應(yīng)用LPS氣管內(nèi)直接滴入法誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型，結(jié)果顯示LPS（0.5 mg/kg，100 μl）氣管滴入24 h后BALF中的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著增加，肺水腫明顯，肺濕/干重指數(shù)增高，肺組織以明顯的炎癥細(xì)胞浸潤、肺毛細(xì)血管通透性增加、肺水腫為主要表現(xiàn);BALF中SOD下降，肺組織中MPO增高，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA顯著表達。這些均提示，LPS首先激活中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板，進一步誘導(dǎo)氧自由基募集，失控性地釋放炎癥因子及溶酶體的產(chǎn)生和釋放，參與ALI的發(fā)生和發(fā)展[9]。其中，早期反應(yīng)細(xì)胞因子IL-1β與TNF-α進一步促進如IL-2、IL-6、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）、MIP-1β等從而誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞遷移趨化，放大炎癥過程，引起級聯(lián)“瀑布效應(yīng)”[10-11]，最終導(dǎo)致血管通透性增高、肺水腫及透明膜形成[12]。

中草藥治療ALI療效確切，并被臨床及實驗研究所證實[13-14]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為ALI的發(fā)生與六淫邪氣、房勞傷腎、情志內(nèi)傷及先天稟賦不足有關(guān)[15-16]。其病位在肺，瘀、痰、熱為標(biāo)，涉及脾腎，屬本虛標(biāo)實之證;而黃芪作為補氣健脾固表之圣藥，先前研究中已明確證實其可有效預(yù)防肺損傷[18-20]。本研究結(jié)果同樣表明黃芪對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷有很強的保護作用。黃芪能夠顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥，包括對炎癥細(xì)胞滲出（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）和促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-6、IL-1β）產(chǎn)生有效抑制。同時黃芪及DEX對ALI小鼠BALF的蛋白滲出均有顯著的抑制作用。因此，黃芪與地塞米松治療ALI肺組織損傷及蛋白質(zhì)滲出療效可能是相近的[18-12]。同時肺組織形態(tài)學(xué)提示黃芪可以減輕LPS誘導(dǎo)所致的肺組織炎癥水腫、出血、肺泡結(jié)構(gòu)及血管損傷性改變。提示黃芪對LPS誘導(dǎo)的肺損傷保護作用可能與其阻止炎癥細(xì)胞向肺泡腔內(nèi)遷移能力有關(guān)。

綜上所述，本研究通過建立黃芪治療小鼠LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型，評估黃芪對小鼠肺損傷的保護作用。發(fā)現(xiàn)黃芪能顯著預(yù)防炎癥細(xì)胞遷移，降低細(xì)胞計數(shù)、減輕肺水腫，降低BALF中總蛋白質(zhì)含量，提高SOD活性，降低肺組織炎癥細(xì)胞因子的表達，并顯著保護LPS誘導(dǎo)小鼠的肺損傷。組織學(xué)研究表明，黃芪可顯著抑制ALI小鼠肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤。結(jié)果表明，黃芪對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI具有保護作用。此外，對詳細(xì)評價黃芪藥理學(xué)機制至關(guān)重要，為ALI的防治研究提供新的實驗基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] Ashbaugh DG，Bigelow DB，Petty TL.Acute respiratory distress in adults[J]. Lancet，1967，2：319-323.

[2] Costa NDSX，Júnior GR，Belotti L，et al.Early and late pulmonary effects of nebulized LPS in mice：An acute lung injury model[J].PLoS One，2017，12（9）：1-16.

[3] Auyenk KK，Han QB，Ko JK，et al. Astragalus membranaceus：A review of its protection against inflammation and gastrointestinal cancers[J].American Journal of Chinese Medicine，2016，44（1）：1-22.

[4] 宣國平，張琳，鐘明媚，等.脂多糖致大鼠急性肺損傷模型取材時間選擇[J].中華實用診斷與治療雜志，2015， 29（2）：136-138.

[5] Yin X，Chen L，Liu Y，et al.Enhancement of the innate immune response of bladder epithelial cells by astragalus polysaccharides through upregulation of TLR4 expression[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，397（2）：232-238.

[6] Reilly JP，Christie JD，Meyer NJ，et al. Fifty years of research in ARDS. Genomic contributions and opportunities[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2017，196：1113-1121.

[7] Matute Bello G，F(xiàn)revert CW，Martin TR，et al. Animal models of acute lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295：379-399.

[8] Broz P，DixitVM.Inflammasomes：Mechanism of assembly，regulation and signalling[J].Nat Rey Immunol，2016， 16（7）：407-420.

[9] Schroder K，Sagulenko V，Zamoshnikova A，et al. Acute lipopolysaccharide priming boosts inflammasome activation independently of inflammasome sensor induction[J].Immunobiology，2012，217（12）：1325-1329.

[10] Li L，Dong L，Zhao D，et al.Classical dendritic cells regulate acute lung inflammation and injury in mice with lipopolysaccharide induced acute respiratory distress syndrome[J].Int J Mol Med，2019，44： 617-629.

[11] 趙燕，程黎，宋志新，等.白介素-17對急性肺損傷時肺水腫液清除的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，37：494-498.

[12] Dolinay T，Kim YS，Howrylak J，et al.Inflammasome regulated cytokines are critical mediators of acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med，2012，185：1225-1234.

[13] Shah A，Rather MA，Hassan QP，et al.Discovery of anti-microbial and anti-tubercular molecules from Fusarium solani：An endophyte of glycyrrhiza glabra[J].Appl Microbiol，2017，122：1168-1176.

[14] Meenu Mehtaabc，Parvarish Sharmaa.Plant-based drug delivery systems in respiratory diseases[J]. Acdemic Press，2020，2020：517-539.

[15] 李小茜，楊愛東.急性肺損傷發(fā)病機制及中醫(yī)辨證治療的思考[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2018，25（1）：9-15.

[16] Wang DY，Yang AD，Guo YJ，et al. Exploration and thinking of traditional Chinese medicine treating acute lung injury[J]. Liaoning J TCM，2008，35（7）：1010-1012.

[17] 徐思娟，彭再梅.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機制的研究現(xiàn)狀與展望[J].中華急診雜志，2014，10（23）：1179-1182.

[18] Lv J，Zhang Y，Tian Z，et al. Astragalus polysaccharides protect against dextran sulfate sodium-induced colitis by inhibiting NFκB activation[J]. International Journal of Bi-ological Macromolecules，2017，9（8）：723-729.

[19] 范穎，喬鐵，滕飛，等.黃芪功效主治的衍化及其應(yīng)用與發(fā)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，8（25）：1164-1167.

[20] 李程豪，任春貞，劉永琦，等.黃芪多糖對IL-6和TNF-α模擬炎性微環(huán)境中BMSCs增殖及TAFs分化的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，7（33）：3039-3042.

（收稿日期：2021-01-05）