梁俊輝 陳澤銳 彭樹明 陳善嘉 舒柏榮

【摘要】 目的 探討叉頭框蛋白B2（FOXB2）對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法 采用定量PCR檢測正常肝細胞LO2細胞和肝癌細胞系Hep3B、Huh7細胞FOXB2 mRNA的表達，構建過表達FOXB2的細胞模型，逆轉錄實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測過表達效率，細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測FOXB2對Huh7細胞增殖能力的影響;平板克隆實驗檢測FOXB2對Huh7細胞克隆形成能力的影響;Transwell實驗檢測FOXB2對Huh7細胞遷移和侵襲能力的影響。結果 FOXB2在肝癌細胞系Huh7和Hep3B細胞中的表達水平低于正常肝細胞LO2（P<

0.001）;過表達FOXB2抑制了Huh7細胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2過表達肝癌細胞的遷移（P<0.001）和侵襲（P=0.002）能力低于Vector對照細胞。結論 FOXB2在肝癌細胞中低表達，F(xiàn)OXB2過表達抑制了肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

【關鍵詞】 肝細胞癌;叉頭框蛋白B2;增殖;侵襲;遷移

Effect of overexpression of forkhead box B2 on proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells Liang Junhui△， Chen Zerui， Peng Shuming， Chen Shanjia， Shu Bairong. △Department of General Surgery， Guangdong Provincial People’s Hospital Nanhai Hospital， Foshan 528200， China

Corresponding author， Shu Bairong， E-mail： shubrmd@163.com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of forkhead box protein B2 （FOXB2） on the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods The expression levels of FOXB2 mRNA in normal liver cells LO2， hepatocellular carcinoma cells Hep3B and Huh7 were detected by quantitative PCR. The cell model overexpressing FOXB2 was constructed. The overexpression efficiency was assessed by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot. The effect of FOXB2 on Huh7 cell proliferation was evaluated by cell counting kit-8 （CCK-8）. The effect of FOXB2 on the clone formation of Huh7 cells was determined by plate cloning assay. The effect of FOXB2 on the invasion and migration of Huh7 cells was detected by Transwell chamber test. Results The expression levels of FOXB2 in hepatocellular carcinoma cells Huh7 and Hep3B were significantly lower than that in normal liver cells LO2 （both P<0.001）. Overexpression of FOXB2 significantly inhibited the proliferation （P=0.005） and clone formation （P<0.001） of Huh7 cells. In the Huh7-FOXB2 overexpression group， the invasion （P=0.002） and migration capabilities （P<0.001） of hepatocellular carcinoma cells were significantly lower than that in the Vector control cells. Conclusions FOXB2 is lowly expressed in hepatocellular carcinoma cells. Overexpression of FOXB2 suppresses the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Hepatocellular carcinoma; Forkhead box protein B2; Proliferation; Invasion; Migration

目前肝細胞癌（肝癌）是病死率較高的惡性腫瘤之一[1]。盡管近年肝癌的基礎和臨床研究取得較大進展，但肝癌患者的5年生存率仍然很低[2]。現(xiàn)有的多種療法依然具有明顯不良反應[3]。尋找早期診斷的生物標志物和潛在的治療靶點，對改善肝癌患者的預后是十分必要的。果蠅胚胎中轉錄調控因子叉頭框蛋白（FOX）在控制細胞周期、上皮分化和代謝以及調節(jié)免疫系統(tǒng)等許多生物學過程中有重要的作用，且具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOXB2是FOX蛋白家族的重要成員之一，研究顯示FOXB2抑制了胰腺癌細胞Panc-1的惡性表型[4]。FOXB2在肝癌中的作用筆者尚未見有相關報道，為此進行本研究，旨在闡明FOXB2在肝癌中的作用。

材料與方法

一、試劑與耗材

胎牛血清（FBS）、雙抗抗生素、高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉染試劑購自賽默飛;細胞培養(yǎng)板（6、24、96孔板）、Transwell小室（8 μm）購自Corning公司;細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、增強型電化學發(fā)光（ECL）試劑購自上海碧云天生物技術有限公司;RNAiso Plus試劑、TB Green? 逆轉錄快速熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑購自寶生物工程有限公司;FOXB2抗體購自Immunoway公司;GAPDH抗體購自Santa Cruz Biotechnology;辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自北京銳抗生物科技有限公司;0.22 μm的聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自Millipore公司;結晶紫購自Sigma-Aldrich公司。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)

正常肝細胞LO2細胞和肝癌細胞系Hep3B、Huh7細胞購自中國科學院細胞庫，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細胞，添加10 000 kU/L的鏈霉素和10 000 kU/L青霉素于培養(yǎng)基中。于細胞培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)，待細胞融合至90%時進行傳代，隔日進行細胞換液。

2. qRT-PCR檢測細胞mRNA表達水平

按照說明書應用RNAiso Plus試劑從細胞中獲取總RNA，NanoDrop測定RNA濃度。RT體系為10 μL，模板DNA產物常規(guī)稀釋10倍;采用TB Green? Fast qPCR Mix試劑進行qRT-PCR檢測mRNA的表達水平。引物由華大基因合成。引物序列：GAPDH上游5’-CTACACTGAGCACCAGGTG

GTC-3’，下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG

-3’，產物長度115 bp;FOXB2上游5’-GCTGAGCG

ACATCTACAAGTTC-3’，下游5’-GAATCTTGATG

AAGCAGTCGTTG-3’，產物長度119 bp。2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量，實驗重復3次。

3. 構建過表達FOXB2細胞系

轉染空載體質粒的Huh7細胞為Vector組，轉染FOXB2重組質粒的Huh7細胞為FOXB2組;細胞轉染的前一日，消化收集細胞，計數(shù)后鋪于24孔板;細胞轉染當日，取Opti-MEM稀釋質粒;加入Lipofectamine 3000，培養(yǎng)20 min;取Lipofectamine 3000在Opti-MEM中稀釋;將混合液加入對應各孔中后搖勻;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測FOXB2 mRNA和蛋白的表達水平。

4. 蛋白免疫印跡法檢測細胞蛋白表達水平

預冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞15 min。BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，10%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白質，0.22 μm PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，抗體（FOXB2 1∶1000;GAPDH 1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次8 min，抗體室溫孵育2 h;TBST洗滌3次，每次8 min，使用增強ECL底物在BIO-RAD Chemidoc XRS凝膠成像系統(tǒng)曝光;使用Image J進行圖像分析。

5. CCK-8法檢測細胞增殖能力

96孔板每孔加入100 μL細胞懸液（含有5×103個細胞），每組3個復孔，不含細胞的培養(yǎng)基作為空白對照（Vector）;然后分別于預先制定好的檢測時間點（24、48、72 h），向檢測孔中加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，于酶標儀上在450 nm處測定吸光度（D450）。實驗重復3次。

6. 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取Vector對照組和FOXB2過表達組的細胞以1×103 /孔的密度鋪板6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)1周，4%多聚甲醛固定細胞后用0.2%結晶紫染色，相機拍照并計數(shù)克隆個數(shù)。實驗重復3次。

7. Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲能力

按試劑盒說明書將5×104細胞接種在24孔板中。預定時間收集細胞并將其懸浮在無血清培養(yǎng)基中。遷移能力時將細胞置于未涂Matrigel膠的上腔室中。侵襲實驗測定時將上室的膜按1∶8稀釋并涂Matrigel膠。所有下腔室均充滿500 μL含25%FBS的培養(yǎng)基。將細胞置于上室培養(yǎng)24 h后，在200倍物鏡下使用顯微鏡在3個視野中對遷移或侵襲的細胞數(shù)量進行計數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 7處理數(shù)據(jù)。結果以 表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、LO2、Hep3B、Huh7細胞中FOXB2 mRNA相對表達量比較

人肝癌細胞系Hep3B、Huh7細胞的FOXB2 mRNA表達水平低于人正常肝細胞LO2細胞（F = 321.6，P < 0.001），見圖1。

二、FOXB2過表達對Huh7細胞增殖的影響

轉染后的qRT-PCR檢測結果顯示，與Vector組細胞相比，F(xiàn)OXB2組細胞的FOXB2 mRNA（t = 21.85，P < 0.001）和蛋白（t = 7.19，P = 0.002）相對表達量均明顯上調，見圖2A～C。CCK-8實驗顯示，過表達FOXB2在72 h明顯抑制了Huh7細胞的增殖能力（t = 5.61，P = 0.005），見圖2D。

三、FOXB2過表達對Huh7細胞克隆形成的影響

平板克隆形成實驗結果顯示，過表達FOXB2明顯抑制了Huh7細胞的克隆形成能力（t = 19.41，P < 0.001），見圖3。

四、FOXB2過表達對Huh7細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，過表達FOXB2明顯抑制了肝癌細胞Huh7的遷移（t = 7.32，P = 0.002）和侵襲（t = 10.58，P < 0.001） 能力，見圖4。

討 論

肝癌仍然是危害人類健康的公共衛(wèi)生難題之一，在全球范圍內仍然有增加的趨勢[1]。盡管近年肝癌的診斷和治療研究方面均取得了長足的進展，但其5年生存率仍然較低，主要原因為肝癌早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，大部分肝癌患者在確診時已處于中晚期，腫瘤細胞已經發(fā)生轉移，而轉移及相關并發(fā)癥是造成肝癌患者死亡的主要原因[5]。肝癌患者根治性切除術后5年累積復發(fā)率約為70%，有大約90%的患者因發(fā)生轉移而死亡[6]。因此，深入研究肝癌的具體分子機制仍然是該領域的重點。

FOX蛋白家族由一組進化上保守的轉錄因子組成，其特征是一個共同的DNA結合域，稱為叉頭盒結構域。該家族包括19個亞族，具有翼狀螺旋DNA結合結構域或稱叉頭結構域，這種結構域具有轉錄激活和抑制作用，使FOX具有腫瘤抑制和潛在致癌的雙重作用。FOX蛋白家族參與細胞生長、分化和其他生物過程。FOX蛋白家族轉錄因子的解除調控對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。在人類中，根據(jù)序列相似性，F(xiàn)OX基因被分為19個亞組。在癌細胞中，許多FOX基因被認為是抑癌基因或促癌基因。例如，F(xiàn)OXO和FOXM1轉錄因子的平衡通過競爭性調節(jié)靶基因胰島素樣生長因子，整合了腺苷5’-磷酸腺苷，活化蛋白激酶介導的代謝和細胞周期調節(jié)。FOXK1和FOXK2在調節(jié)線粒體功能、代謝和凋亡中起重要作用[7]。作為FOX家族蛋白的一員，BRAF突變陽性的結直腸癌中FOXB2的5’區(qū)CpG島存在異常甲基化。Fukuchi等[4]研究顯示，F(xiàn)OXB2在胰腺癌細胞系Panc-1細胞中低表達，其5’端的CpG島高度甲基化，表明FOXB2可能受到抑制，進一步研究發(fā)現(xiàn)FOXB2抑制了Panc-1細胞的惡性特征。

本研究顯示，與正常肝細胞相比，F(xiàn)OXB2在肝癌細胞中低表達;過表達FOXB2抑制了肝癌細胞的增殖和克隆形成能力，同時降低了肝癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究初步探討了FOXB2在肝癌中的作用，為后續(xù)的研究奠定了一定的基礎，但FOXB2在肝癌中的具體作用機制依然不明確，日后將進一步研究FOXB2在肝癌中的具體分子機制。為改善肝癌患者的預后，發(fā)現(xiàn)新的肝癌藥物干預靶點提供理論依據(jù)。

參 考 文 獻

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

[2] Erstad D J， Tanabe K K. Prognostic and therapeutic implications of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol， 2019， 26（5）：1474-1493.

[3] Lee D H， Lee J M， Kim P N， et al. Whole tumor ablation of locally recurred hepatocellular carcinoma including retained iodized oil after transarterial chemoembolization improves progression-free survival. Eur Radiol， 2019， 29（9）：5052-5062.

[4] Fukuchi H， Hayashida Y， Inoue K， et al. Forkhead box B2 inhibits the malignant characteristics of the pancreatic cancer cell line Panc-1 in vitro. Genes Cells， 2019， 24（10）：674-681.

[5] Villanueva A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med， 2019， 380（15）：1450-1462.

[6] Rankin E B， Giaccia A J. Hypoxic control of metastasis. Science， 2016，352（6282）：175-180.

[7] Sakaguchi M， Cai W， Wang C H， et al. FoxK1 and FoxK2 in insulin regulation of cellular and mitochondrial metabolism. Nat Commun， 2019， 10（1）：1582.

（收稿日期：2021-05-18）

（本文編輯：林燕薇）